微量肉汤稀释法药敏检测法.docx

微量肉汤稀释法药敏检测法 微量肉汤稀释法药敏检测以下试验方法主要适用于需氧菌及局部兼性厌氧菌〔以大肠杆菌为例〕，微需养菌和厌氧菌的造就条件亟待摸索本试验方法，虽然操作较为繁琐，但是能够准确的得到细菌临床分别株对某种抗菌药物的MIC值，以此作为临床用药指导的局部依据 菌悬液的制备：① 菌液造就：取待测菌保存液10μL参加1mLMH肉汤〔可依据实际须要做调整〕，置37℃温箱过夜静止造就12小时左右；② OD600值测定：利用紫外分光光度仪测定OD值，MH肉汤调整菌液浓度使其OD600值落在0.08-0.1之间，此时菌液浓度约10cfu/mL〔大约需将造就菌液稀释7-10倍左右〕； ③ 上样菌液稀释：将待测菌液在步骤②所得稀释倍数的根底上再稀释1010倍，此时菌液浓度约10cfu/mL〔即7000-10,000倍〕，此时的菌液即为上样菌悬液； 留意：测定OD值所需菌液应在超净台中无菌取样，剩余菌液还需试验 抗菌药物的制备：抗生素母液配制：参照NCCLS标准上抗菌药物相应的R〔抗药〕值制备待测抗菌药物〔母液浓度要远远大于R值，至少160倍〕，分装于无菌小管置-20℃备用〔附件一.常用抗生素溶液的配制〕。

58留意：无菌操作，抗菌药物的稀释液均需灭菌，溶解后还应过滤〔滤膜孔径为0.22μm〕 药敏试验的操作：① 将待测抗菌药物进展10倍稀释；② 无菌96孔板第1-11列参加灭菌MH肉汤101μL〔一药一板〕；③ 无菌96孔板第1列参加10倍稀释的药液101μL，逐次倍比稀释至第11列〔每孔液体终体积是101μL〕；④ 无菌96孔板的每一孔参加待测菌液101μL，每孔液体终体积是200μL〔由于整板都是一种药物，所以96孔板的每一行可进展一种细菌的药敏试验，为了保证明验的牢靠性，每株菌进展一次重复，即一株菌做两行，一块板可做四株细菌的药敏试验〕；⑤ 无菌96孔板的第12列上4孔参加200μL/孔灭菌MH肉汤作为阴性参照，第12列下4孔参加200μL/孔菌液〔四株菌的菌液〕作为阳性参照；⑥ 药物和菌液上样完毕后，盖好板盖，置37℃温箱造就18-22小时视察结果〔结果的判读请参照附件二. 2022年NCCLS抗菌药物敏感性试验说明标准〕 留意：无菌操作 96点阵法药敏检测〔大通量的药物敏感性检测试验〕以下试验方法主要适用于需氧菌及局部兼性厌氧菌〔以大肠杆菌为例〕，微需养菌和厌氧菌的造就条件亟待摸索。

该方法能够快速得到某种抗菌药物对细菌临床分别株的作用，抗药还是敏感，以此作为临床用药指导的局部依据 菌悬液的制备：① 菌液造就：无菌96孔板造就96株待测菌株〔每一孔对应一株菌〕，每孔含有灭菌MH肉汤200μL，待测菌株保存液5μL，置37℃温箱过夜静止造就12小时左右；② 上样菌液稀释：将过夜造就所得菌液稀释1010倍〔运用无菌96孔板分三次进展稀释，每次稀释10倍，最终一次稀释所得菌液即为上样菌悬液〕； 抗菌药物的制备：抗生素母液配制：参照NCCLS标准上抗菌药物相应的R〔抗药〕值制备待测抗菌药物〔母液浓度要远远大于R值，至少101倍〕，分装于无菌小管置-20℃备用〔附件一.常用抗生素溶液的配制〕 药敏试验的操作：① 用本试验室新定制的细菌造就瓶配制MH固体造就基，定量35mL，灭菌；② 待MH固体造就基灭菌完毕，温度降至45℃左右时，参加必须量的抗菌药物，使其终浓度为R值〔R值确实定请参照附件二. 2022年NCCLS抗菌药物敏感性试验说明标准〕，混匀，倒入96点阵药敏检测板底座内，用预先灭好菌的96孔板盖进展加盖；③ 用灭好菌的96点阵药敏检测板的锥体盖对应蘸取96孔板内已稀释好的上样菌悬液，轻轻盖在96点阵药敏检测板底座的药物造就基对应位置上；④ 置37℃温箱造就18-22小时视察结果。

假如锥体接触的造就基位置长菌，说明该菌对板内药物抗药；假如不长菌，说明该菌对板内药物敏感留意：①在倾倒造就基时，务必确保三个无菌，96点阵药敏检测板的底座、锥体盖及96孔板盖无菌此外，操作时，请勿将手随意在造就基外表晃动，刚好盖盖；②往造就基中加抗生素时，必须限制好造就基的温度，温度过高，药物会失效；温度过低，造就基会凝固，药物混合不匀称 纸片扩散法药敏检测以下试验方法主要适用于需氧菌及局部兼性厌氧菌〔以大肠杆菌为例〕，微需养菌和厌氧菌的造就条件亟待摸索该方法能够快速、精确地得到某种抗菌药物对细菌临床分别株的作用，抗药还是敏感，以此作为临床用药指导的局部依据 菌悬液的制备：① 菌液造就：取待测菌保存液10μL参加1mLMH肉汤〔依据实际须要可做调整〕，置37℃温箱过夜静止造就12小时左右；② 用无菌生理盐水，参照0.5麦氏比浊管矫正菌液浓度； 抗菌药物纸片和造就基的制备：① 抗菌药物纸片可以从试剂公司干脆购置，杭州天和等多家试剂公司均售〔国产和进口〕； ② 将灭菌MH固体造就基倒入无菌平板中，9cm平板中造就基高度约4cm； 药敏试验的操作：① 用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在造就基外表匀称涂抹3次，每次60°，最终沿平板内缘涂抹一周；② 平板置室温下枯燥3-5分钟，用无菌镊子将药物纸片当心紧贴于造就基外表，各纸片中心相距>24mm，纸片距平板内缘>15mm，纸片贴上后不行再移动；③ 置37℃温箱造就16-18小时视察结果〔结果的判读请参照附件二. 2022年NCCLS抗菌药物敏感性试验说明标准〕。

留意：①在涂抹菌悬液时，保证造就基外表枯燥无水；②在贴药敏纸片时，必须要稳、准，不能在造就基外表来回移动，水平放置，轻轻按压即可；③药敏制片相聚不能太近，否那么会影响结果的判读牛津杯法药敏检测牛津杯是药学和理学试验室中常用的根底试验器材，用牛津杯法做抑菌试验要留意以下几点事项：①首先要把平板倒好，必须要平，才能保证杯内抑菌物质匀称地向四周扩散；②不要封口，常用的生物法测定抗生素采纳杯碟法，“杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径6nm，高10nm的圆筒形管子，管子重量尽可能相等，碟是摊布造就基的玻璃造就皿药敏试验操作方法〔一〕：① 将已灭菌的琼脂造就基加热至完全溶化，倒在造就皿内，每碟15mL〔下层〕，待其凝固； ② 将溶化的造就及冷却到50℃左右混入试验菌，将混有菌的造就基5mL加到已经凝固的培养基上待其凝固〔上层〕③ 在造就基外表垂直放上小杯，杯中参加待检样品，加满后在37℃造就16-18小时造就中，一方面试验菌起先生长，另一方面抗生素成球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小随着抗生素浓度减小，有一条是最低抑菌浓度带，在带范围内，细菌不能生长，而呈透亮的圆圈，这就叫“抑菌圈”，抗生素浓度越高，抑菌圈越大。

药敏试验方法〔二〕：① 在“超净台”中，用经〔酒精灯〕火焰灭菌的接种环挑取适量细菌造就物，以划线方式将细菌涂布到平皿造就基上详细方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点起先划线涂菌至平皿的1/2然后，找到其次点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌匀称密布于平皿〔另：可挑取待试细菌于少量生理盐水，参照0.5麦氏比浊管矫正菌液浓度制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿造就基外表要求涂布匀称致密；② 以无菌操作将灭菌的不锈钢小管〔内径6nm、外径8nm、高10 nm 的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管〕，放置在造就基上，轻轻加压，使其与造就基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称每个平板可放4-6支小管待放好后，分别向各小管中滴加必须数量的待测抗菌药物药液，勿使其外溢置37℃造就8-18小时，视察结果 ③ 将平皿造就基置于37℃温箱中造就24小时后，视察效果 联合法药敏检测体外联合药敏试验的目的在于：①扩大抗菌谱，治疗混合感染；②预防或推迟细菌抗药性的发生；③联合用药还可以计量以幸免到达毒性剂量；④对某些抗药细菌引起的紧要感染，联合用药比单一用药时效果更好。

抗菌药物联合应用可出现以下4种结果：①无关作用，两种药物联合作用的活性等于其单独活性；②拮抗作用，两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性；③相加作用，两种药物联合作用的活性等于两种单独抗菌活性之和；④协同作用，两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和 药敏试验方法：棋盘稀释法是目前临床试验时常用的定量方法，利用肉汤稀释法原理，首先分别测定拟联合的抗菌药物对待测菌的MIC依据所得MIC，确定药物稀释度〔一般为6-8个稀释度〕，药物最高浓度为其MIC的2倍〔即2MIC〕，依次比照稀释两种药物的稀释分别在方阵的横列和纵裂，这样在每管〔孔〕中可得到不同浓度组合的两种药物混合液接种菌量为5×10CUF/ml，37℃孵育18-24小时后视察结果计算局部抑菌浓度指数〔fractional inhibitory concentration，FIC〕指数 计算公式及判定标准：5 留意：混合药液的稀释是很麻烦的一项操作，必须要细心！混合药液的稀释，可沿对角线依次倍比稀释！ 附件一.抗菌药物贮备液制备用溶剂和稀释剂抗菌剂 阿米卡星Amikacin 阿莫西林Amoxicillin 氨苄西林Ampicillin 安普霉素Apramycin 阿奇霉素Azithromycin 头孢唑啉cefazolin 头孢噻呋Ceftiofur 头孢噻吩Cephalothin 头孢氨苄cephalexin 溶剂 水 磷酸缓冲液pH6.0, 0.1mol/L 磷酸缓冲液pH8.0, 0.1mol/L 95%乙醇 95%乙醇或冰乙酸 磷酸缓冲液PH6.0, 0.1mol/L 水或肉汤 磷酸缓冲液pH 6.0, 0.1mol/L 磷酸缓冲液PH6.0, 0.1mol/L 95%乙醇 水 磷酸缓冲液pH 6.0, 0.1mol/L 水 水 稀释剂 磷酸缓冲液pH6.0, 0.1mol/L 磷酸缓冲液pH6.0, 0.1mol/L 水 肉汤造就基 磷酸缓冲液PH6.0, 0.1mol/L 水或肉汤 水 水 水 磷酸缓冲液pH 6.0, 0.1mol/L 水 氯霉素Chloramphenicol 环丙沙星Ciprofloxacin 克拉维酸Clavulanic acid 克林霉素Clindamycin 硫酸黏菌素Colistina 达氟沙星danofloxacin 1/2体积水，逐滴参加1mol/L 水 NaoH 至溶解 1/2体积水，逐滴参加1mol/L 水 NaoH 至溶解 水 1/2体积水，逐滴参加1mol/L 水 NaoH 至溶解 95%乙醇或冰乙酸 95%乙醇 水 水 二氟沙星difloxacin 强力霉素doxycycline 恩诺沙星enrofloxacin 红霉素erythromycin 氟苯尼考florfenicol 氟甲喹flumequine 庆大霉素Gentamicin 卡那霉素Kanamycin 左氧氟沙星levofloxacin 麻保沙星marbofloxacin 甲氧西林methicillin 1/2体积水，逐滴参加1mol/L 水 NaoH 至溶解 水 水 1/2体积水，逐滴参加0.1mol/L NaoH 至溶解 水 1/2体积水，逐滴参加1mol/L 水 NaoH 至溶解 水 萘啶酸Nalidixic acld 呋喃妥因nitrolurantoinc 诺氟沙星Norfloxacln 新生霉素novobiocin 氧氟沙星ofloxacin 苯唑西林oxacillin 土霉素oxytetracycline 青霉素penicillin 吡利霉素pirlmycin 多粘霉素B Polymywin B 利福平Rifampin 大观霉素Spectinomycin 链霉素Streptomycin 磺胺Sulfonamides。