γ射线与LPS作用于小鼠巨噬细胞RAW264.7的生物学效应.doc

1γ 射线与 LPS 作用于小鼠巨噬细胞 RAW264.7 的生物学效应作者：饶亚岚, 丛 悦, 陈肖华*, 董波, 李峰生, 张军权, 高玲, 毛秉智【摘要】 目的: 研究 γ 射线与 LPS 协同激活小鼠巨噬细胞 RAW264.7 的效应机制, 以及 γ 射线与 LPS 诱导钙结合蛋白 S100A8 的表达及意义方法: 相差显微镜观察细胞形态; 流式细胞计数方法检测细胞周期及活性氧介质（ROI）水平; Griess 颜色反应测定细胞 NO 水平; 实时定量 RTPCR 方法检测细胞 S100A8 mRNA 水平的表达结果: γ 射线与 LPS 作用于 RAW264.7 细胞引起细胞形态改变, 部分细胞出现非整倍性, 少量细胞出现凋亡, 胞内 ROI 水平、 NO 水平明显升高, S100A8 分子 mRNA 水平明显升高, 而且这些效应几乎都比 γ 射线或 LPS 单因素的作用要强结论: γ 射线与 LPS 协同诱导巨噬细胞激活是细胞周期改变、 信使分子水平变化、 炎症因子如 S100A8 的表达等多方面生物效应的综合结果, 其中 S100A8 基因的表达与巨噬细胞功能状态密切相关。

【关键词】 巨噬细胞; γ 射线; LPS; S100A8巨噬细胞在整个免疫反应中起极为重要的作用, 辐射后许多组织和器官损伤都涉及到巨噬细胞的功能异常, 巨噬细胞的辐射效应一直受到重视巨噬细胞通常具有辐射抗性, 但已有多篇报道证明电离辐射能够促进或直接激活巨噬细胞一氧化氮（nitric oxide, NO）的生成是巨噬细胞被激活的重要标志, 单纯的射线不能引起小鼠巨噬细胞 J774.1 和 RAW264.7 细胞中 NO 水平的改变, 但 0.5～10 Gy 射线预处理能够触发这些巨噬细胞为干扰素 γ（interferonγ, IFNγ）和（或）脂多2糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导生成 NO, 而且呈现剂量效应关系［1］钙结合蛋白 S100A8 是 S100 蛋白家族成员, 是一个多功能分子, 其最主要的功能是参与免疫炎症反应过程［2］Stassen 等［3］研究发现, 6 Gy X 射线照射MCF7 细胞后 48～72 h, S100A8 被诱导表达, 其 mRNA 水平呈现辐射剂量效应关系静息态的巨噬细胞不表达 S100A8, 激活状态的巨噬细胞才表达 S100A8分子, S100A8 在巨噬细胞中为 LPS 等炎症因子诱导表达［4］。

既然 S100A8 能够为电离辐射及 LPS 诱导表达, 那么我们需要进一步研究在巨噬细胞中, 电离辐射是否与 LPS 协同诱导 S100A8 以及 S100A8 的表达与巨噬细胞功能状态之间的关系本研究观察比较了 RAW264.7 细胞受 10 Gy γ 射线照射后 24 h, 5 mg/L LPS继续处理 24 h 与正常对照、 相应单纯 γ 射线或单纯 LPS 处理组细胞形态、 周期、活性氧介质（reactive oxygen intermediates, ROI）水平、 NO 水平及 S100A8 mRNA 等指标的改变并探讨相互之间的关系1 材料和方法1.1 材料 试剂 LPS、 2’7’二氯荧光素双醋酸盐(2, 7dichlorofluorescin dictate, DCFHDA)、 碘化丙啶(propidium iodide, PI)为美国 Sigma 公司产品RPMI1640培养基干粉、 胎牛血清、 TRIzol 试剂为美国 Invitrogen 公司产品随机引物、 MMLV 逆转录酶为美国 Promega 公司产品BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit 为杭州博日公司产品。

FACS Calibur 流式细胞仪为美国 BD 公司产品Linegene 荧光定量 PCR 检测系统为杭州博日公司产品1.2 方法1.2.1 RAW264.7 细胞培养及处理 小鼠巨噬细胞 RAW264.7 细胞于含 100 mL/L3胎牛血清的 RPMI1640 培养液, 37℃、 50 mL/L CO2 饱和度条件下培养对数增殖期细胞照射前 24 h, 换新鲜培养基, 不辐射或 10 Gy 60Co γ 射线照射, 照射后24 h, 不加或加入 5 mg/L LPS, 继续培养 24 h相差显微镜观察细胞形态变化1.2.2 流式细胞术测定细胞周期 乙醇固定骨髓单细胞悬液, PI 染色, 流式细胞仪检测, 具体按文献［5］进行1.2.3 流式细胞术测定 ROI 水平 约 1×106 RAW264.7 细胞铺种于 6 孔板中, 培养过夜, γ 射线或(和)LPS 处理后不同时间收集细胞, 用无血清 RPMI1640 培养液洗 2 遍细胞后, 20 μmol/L DCFHDA 悬浮细胞, 37℃孵育 30 min, 无血清RPMI1640 培养液洗涤 1 遍后, 0.5 mL 无血清 RPMI1640 培养液悬浮细胞, 流式细胞仪检测。

1.2.4 NO 水平检测 通过 Griess 颜色反应测定细胞培养上清中 NO-2 水平, NO-2水平以吸光值 A550 表示, 具体方法参照文献［1］进行1.2.5 实时定量 RTPCR 检测 S100A8 表达 用 TRIzol 试剂提取 RAW264.7 细胞总 RNA, 经紫外分光仪检测 A260 和 A280, 测定浓度和纯度取总 RNA 2 μg, 随机引物 0.5 μg, M MLV 逆转录酶 200 U, 进行 25 μL 体系反转录每 PCR 反应取 2 μL 反转录产物为模版, 加入 BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit 试剂, 于荧光定量 PCR 检测系统进行实时定量 PCR 扩增测定 CT（Treshhold cycle）值小鼠 S100A8 上游引物 5′ATCACCATGCCCTCTACAAGA3′, 下游引物5′TGCTACTCCTTGTGGCTGTCT3′看家基因 3磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase, GAPDH）上游引物 5′CCATGGAGAAGGCCGGGG3′, 下游引物45′CAAAGTTGTCATGGATGACC3′。

用比较 CT 方法, 以看家基因 GAPDH 为内参, 以未处理正常细胞中 S100A8 mRNA 水平为 1, 相对定量 γ 射线或(和)LPS处理后 S100A8 mRNA 的表达水平相对表达倍数=2^(-△△CT), 其中△△CT=γ 射线或(和)LPS 处理样品的△CT -正常对照的△CT, △CT=S100A8 的 CT-GAPDH 的CT 1.2.6 统计学分析 所有数据均以 x±s 表示, 应用 SAS9.13 统计软件进行两因素析因设计资料的方差分析2 结果2.1 RAW264.7 细胞形态学改变 观察比较 RAW264.7 细胞受 10 Gy γ 射线照射后 24 h, 5mg/L LPS 继续处理 24 h 与正常对照、 相应单纯 γ 射线或单纯 LPS 处理组细胞形态学变化, 可见正常 RAW264.7 细胞为圆形, 贴壁生长; 单纯 γ 射线或单纯 LPS 处理的细胞变大, 部分细胞伸出伪足、 呈梭形, 胞内颗粒增多, 两种处理细胞形态学改变类似; γ 射线与 LPS 共同作用的细胞变得更大, 胞内大量颗粒物, 巨噬细胞呈现被激活状态2.2 RAW264.7 细胞倍性、 凋亡的改变 正常未处理的 RAW264.7 细胞中非整倍性（aneuploid）细胞、 凋亡细胞百分数均为 0%; 10 Gy γ 射线照射后 24 h, 5 mg/L LPS 继续处理 24 h 及相应单纯 γ 射线或单纯 LPS 处理条件下, 细胞均出现部分非整倍性细胞; 而只在 γ 射线与 LPS 共同作用条件下, 细胞才出现明显凋亡（图1）。

2.3 RAW264.7 细胞胞内 ROI 水平的改变 观察 10 Gy γ 射线照射后 0～24 h 胞内 ROI 水平的动态变化, 照后即刻开始升高, 6 h 达高峰, 24 h 基本恢复到正常水5平（图 2）, 可见胞内 ROI 早期生成明显, 随后下降, 因此我们比较细胞受各种处理后 6 h, 胞内 ROI 水平的改变单纯 10 Gy γ 射线照射后 30 h（即 10 Gy γ 射线照射后 24 h, 0 mg/L LPS 继续处理 6 h）, 胞内 ROI 水平不变; 单纯 5 mg/L LPS 处理后 6 h（即 0 Gy γ 射线照射后 24 h, 5mg/L LPS 继续处理 6 h）, 胞内 ROI 水平升高; 10 Gy γ 射线照射后 24 h, 5 mg/L LPS 继续处理 6 h, 胞内 ROI 水平明显升高, 从测定数值看, 明显高于单纯 5 mg/L LPS 处理后 6 h 或单纯 10 Gy γ 射线照射后胞内 ROI 的水平（图 3, 图 2）图 2 10 Gy γ 射线照射后 0～24 h 胞内 ROI 水平的变化 2.4 RAW264.7 细胞 NO 水平的变化 单纯 γ 射线照射, 胞内 NO 水平不变; 单纯 LPS 处理条件下, 与正常对照相比, 胞内 NO 水平升高; 10 Gy γ 射线照射后 24 h, 5 mg/L LPS 继续处理 24 h, 胞内 NO 水平明显升高, 而且高于单纯 LPS 处理组, 表明 γ 射线能够促进 LPS 增强巨噬细胞 RAW264.7 中 NO 水平（图 4）。

2.5 RAW264.7 细胞中 S100A8 分子 mRNA 表达水平的改变 实时定量 RTPCR方法检测胞内 S100A8 mRNA 水平的变化以未处理正常细胞中 S100A8 mRNA水平为 1, 单纯 10 Gy γ 射线处理条件下, 胞内 S100A8 mRNA 水平为 9.0±2.3; 单纯 5 mg/L LPS 处理条件下, 胞内 S100A8 mRNA 水平为 86.0±8.3; 10 Gy γ 射线与 5 mg/L LPS 共同作用条件下, 胞内 S100A8 mRNA 水平为 630.0±70.8可见, γ射线、 LPS 均可诱导巨噬细胞 RAW264.7 中 S100A8 mRNA 表达, LPS 的作用强于 γ 射线, 而且 γ 射线与 LPS 具有协同作用3 讨论我们的研究表明, RAW264.7 细胞受 10 Gy γ 射线照射后 24 h, 5 mg/L LPS 继续处理 24 h 条件下, γ 射线与 LPS 共同作用影响细胞多方面的生物学效应, 具体表6现为细胞体积明显变大, 胞内大量颗粒物, 呈现被激活状态; 部分细胞呈现非整倍性, 少量细胞出现凋亡; 胞内 ROI 水平、 NO 水平明显升高; S100A8 分子mRNA 水平明显升高, 而且这些效应几乎都比 γ 射线或 LPS 单因素的作用要强。

γ 射线与 LPS 共同作用使 RAW264.7 细胞形态改变, 胞内大量颗粒物的出现可能反应了细胞酶活性的改变我们检测了 RAW264.7 细胞受 0～40 Gy γ 射线照射后 0～72 h 细胞倍性、 周期、 凋亡的改变, 发现随时间、 剂量不同, 细胞周期呈动态改变, 但细胞几乎不出现凋亡, 只在 γ 射线与 LPS 共同作用条件下细胞才出现凋亡, 一定程度说明细胞具有辐射抗性; 部分细胞呈现非整倍性, 而且这部分细胞 DNA 含量为正常未处理细胞的两倍, 非整倍性的出现可能与细胞分裂受到抑制、 细胞功能的改变或细胞分化状态相关ROI 和 DNA 损伤是辐射信号转导中的主要信使分子我们观察到 0～40 Gy 射线照射后 6 h, RAW264.7 细胞胞内 ROI 水平随照射剂量增加呈现增强趋势, LPS能。