细胞生物学的研究方法.ppt

医学细胞生物学（配套教材）,第三章 细胞生物学研究方法,Technology for Cell Biology,学习目的与要求,掌握细胞生物学基本研究方法的原理和应用熟悉细胞生物学基本研究方法的技术特点了解细胞生物学研究方法的进展第三章 细胞生物学研究方法,Technology for Cell Biology,第一节 显微镜技术,一、光学显微镜技术二、电子显微镜技术三、纳米显微技术四、超分辨光学显微技术,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率1.分辨率（resolution，R） 显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能分辨 被检物体微细结构最小间隔的能力一、光学显微镜技术,Cell,2010(143):1047-1058,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率,一、光学显微镜技术,不同显微结构的尺寸,由左至右依次为动物细胞、细菌、线粒体、流感病毒、核糖体、绿色荧光蛋白、胸腺嘧啶虚线为光学显微镜分辨极限。

Cell,2010(143):1047-1058,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,2.分辨率公式,n = 聚光镜和物镜之间介质的折射 率，空气为1，油为1.5θ= 标本对物镜镜口张角的半角， sinθ的最大值为1λ= 照明光源的波长，白光0.5 m 横向分辨率 Rx,y=0.61λ/n·sinθ,纵向分辨率 Rz=2λ/(n·sinθ)2,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率,一、光学显微镜技术,3.组织切片制备过程⑴ 固定（fixation） 使大分子交联而保持在原有的位置上，防止结构移位或信息丢失 常用的固定剂：戊二醛、甲醛⑵ 包埋（embedding） 使组织形 成硬块，便于切片 常用的包埋剂：石蜡、树脂,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率,一、光学显微镜技术,3.组织切片制备过程⑶ 切片（section） 切片厚度为1～10m。

⑷ 染色（staining） 增大反差Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率,一、光学显微镜技术,组织切片制备过程,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,宫颈鳞癌组织切片,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像1.荧光和荧光染料⑴ 荧光荧光分子可以在吸收特定波长的光后，发射出更长波长的可见光，称为荧光前者称为激发光 (excitation light)，后者称为发射光(emission light)⑵ 荧光染料由于荧光分子可以使被检样品呈现不同的染色，因此也称荧光染料Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,常见荧光分子的激发光与发射光波长范围,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,荧光素(fluorescein)，绿色荧光,四甲基罗丹明(tetramethyrhodanmine)，红色荧光,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,,(二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像,2.荧光显微镜工作原理荧光显微镜（fluorescence microscope）的结构特点： 以高压汞灯和弧光作为光源。

两组滤光片荧光显微镜的光学系统,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,,(二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像,3.应用成像反差强，检测灵敏度高 定性、定位和定量的研究组织内的荧光标记物质对活细胞内分子的动态变化进行实时观察Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,(三)相差显微镜通常被用于观察活细胞,原理：,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,相差显微镜（phase contrast microscope）：利用光的衍射和干涉效应把透过标本不同区域的光波的光程差变成振幅差，使活细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比三)相差显微镜通常被用于观察活细胞,应用：活细胞观察,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,相差显微镜观察培养中的HeLa细胞,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,相差显微镜下观察到的悬浮生长的昆虫草地夜蛾卵巢Sf9细胞,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,原理：散射光成像。

应用：分辨率不高适合观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和真菌等四)暗视野显微镜通过散射光成像,暗视野显微镜工作原理,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,(五)显微电影摄影技术记录细胞或细胞器的运动过程 原理：用显微电影摄影术或电视录像以一定时间间隔拍摄应用：准确记录细胞或细胞器的运动过程和速度Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,(六)共聚焦激光扫描显微镜可以提供高清晰的彩色 三维图像,原理：单色激光作为光源共聚焦：物镜和聚光镜互相共焦点，只有从标本焦面发出的光线聚焦成像，焦面以外的漫射光不参加成像逐点扫描Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,(六)共聚焦激光扫描显微镜可以提供高清晰的彩色 三维图像,应用：进行连续的光学切片，通过电脑进行 三维重建Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,共聚焦激光显微镜工作原理示意图,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,共聚焦激光显微镜下的血管内皮细胞微丝的分布,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,共聚焦激光显微镜获得被检物体三维结构的原理及呈现的三维图像,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,以电子束作光源，波长短，分辨率高。

电子显微镜分辨率 理论值：0.002nm 实际值：0.1nm 生物样品：2nm 电镜下观察到的结构称为超微结构二、电子显微镜技术,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(一)透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM ）,光学显微镜与透射电子显微镜的比较,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,透射电子显微镜标本制备过程：⑴ 固定：双重固定——锇酸固定脂类，戊二醛固定蛋白⑵ 脱水：含水标本干扰观察⑶ 包埋：环氧树脂是常用包埋剂一)透射电子显微镜,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,透射电子显微镜标本制备过程⑷ 切片：电子的穿透力有限，需制作超薄切片，厚度通常为50~100nm⑸ 染色：生物分子散射电子能力弱，需通过重金属染色，增大反差，常用锇、铀、铅等重金属的盐类一)透射电子显微镜,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,(二)扫描电子显微镜（scanning electron microscope， SEM）,原理：通过电子束照射在标本后产生的二次电子成像，二次电 子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关。

应用：可以直接观察标本表面的三维形态《科学》Scientific American 中文版,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,(二)扫描电子显微镜,《科学》Scientific American 中文版,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,扫描电镜的工作原理,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,扫描电镜观察的有丝分裂中期染色体形态（中国医科大学宋今丹提供）,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,凋亡细胞及凋亡小体透射电镜照片(左)和扫描电镜照片(右)，显示凋亡细胞的细胞核固缩，凋亡小体正从细胞脱落（中国医科大学宋今丹提供）,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(三)透射电子显微镜借助金属投影、冰冻断裂及冰冻蚀刻技术可获取三维图像,1.金属投影法（metal shadowing） 原理：以一定的倾斜角度向样品表面喷重金属，显示 投影效果，给出样品表面三维结构。

应用：观察蛋白、核酸类大分子，病毒颗粒及细胞壁,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,2.冰冻断裂（freeze-fracture）,样品制备：,应用：观察细胞膜性结构的内部构造Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,2.冰冻断裂（freeze-fracture）,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,叶绿体内膜冰冻断裂复形，显示内膜上存在大量膜蛋白,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,3.冰冻蚀刻（freeze-etch）,应用：观察细胞的内部构造样品制备：,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,3.冰冻蚀刻（freeze-etch）,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,冰冻蚀刻显示昆虫肌肉细胞中的蛋白纤维,,,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,三、纳米显微技术,纳米尺度：1nm～100nm 生命是纳米尺度的分子活动，细胞是纳米组装机的集合体。

扫描隧道显微镜和原子力显微镜的分辨率和可操控的颗粒在纳米水平，被称作纳米显微技术。