人胚胎生殖细胞体外培养条件的优化及细胞移植的实验研究【临床医学论文】.doc

临床医学论文-人胚胎生殖细胞体外培养条件的优化及细胞移植的实验研究作者：李芳，陈永珍，张于娟，李金【摘要】 目的：优化人胚胎生殖细胞（EG 细胞）的体外培养体系，并将生长状态良好的传代的人 EG 细胞移植用于大鼠心肌梗死模型的治疗，探讨人胚胎生殖细胞进行异种移植对大鼠心肌梗死的治疗机制方法：取 5~10 周人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜，用添加和不添加细胞因子的两种培养体系对比进行组织块原代及传代培养，选取生长情况良好的传至第 4 代的人 EG 细胞，移植到急性心肌梗死大鼠的梗死心肌周围，分别于移植后 1 天、1、2、4 周处死大鼠，以鼠抗人细胞核抗体 MAB1281 作为示踪剂[1]，通过免疫组化方法检测移植细胞的分布结果：在培养液中添加 LIF 和 b-FGF 后原代及传代培养的人 EG 细胞生长旺盛，形成集落更早，传到第 4 代形成的集落体积变化不大；移植组人 EG 细胞在移植后 1 天、1 周、2 周、4 周均可以在心梗区域观察到 MAB1281 阳性细胞结论：添加 LIF 和 b-FGF 的培养体系是更高效的人 EG 细胞培养体系人 EG 细胞可异种移植，人 EG 细胞在大鼠心肌梗死处由心外膜层逐渐向心肌层迁移。

【关键词】 人胚胎生殖细胞；白血病抑制因子；碱性成纤维细胞生长因子；心肌梗死；细胞移植[Abstract] Objective: To optimize the culture system of hEGcs in vitro, select the hEGcs from subculture to transplant directly to the rat infarcted myocardium and observe the therapeutic mechanism of their heterotransplantation in the treatment for the rat myocardial infarction. Methods: The hEGcs from the gonadal ridges and dorsal mesenteries of human embryos aged 5-10 weeks were cultured with or without cytokine in culture medium to observe their growth and the effects of different cell culture systems were compared. The hEGcs’ from passage 4 were transplanted directly to infarcted myocardium. The rats with acute myocardial infarction were separately sacrificed at the end of 1 day, 1 week, 2 weeks, and 4 weeks after implantation. A monoclonal antibody specific for human cellular nuclei (MAB1281) was used to identify hEGCs and to observed the survival , migration and distribution of transplanted cells. Results: hEGcs grew better in the medium added with LIF and bFGF , the shape of the clusters was well maintained in the passage 4. Conclusions: The medium added with LIF and bFGF is efficient .The hEGcs can be used in heterotransplantation ,and the transplanted cells migrate from the epicardium to the myocardium and differentiate into cardiac myocytes gradually.[Key Words] Human embryonic germ cell ; LIF ; bFGF ; Myocardium infarction ; Cell transplantation随着人们物质生活水平的提高，饮食结构的变化，以及我国人口的老龄化，急性心肌梗死已经成为危害国民健康的主要疾病之一。

目前尚无确切证据表明心肌本身存在特异的干细胞，成熟心肌细胞属于终末分化细胞，丧失再生能力，仅仅局限于存活部分的心肌,不能有效修复心肌组织因此心肌梗死后坏死的心肌只能由成纤维细胞取代，形成无收缩功能的瘢痕组织，最终导致心力衰竭而威胁生命因此，寻求一种更新更好的治疗手段，成为临床的当务之急用干细胞作为种子细胞运用细胞移植的方法，进行急性心肌梗死的治疗，目前越来越受到研究人员的关注，早在 1996 年 Klug 等已开始了 ESCs 在体心肌细胞成形术研究[2]人胚胎生殖细胞（embryonic germ cells,EG 细胞）是源于人原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）的一类胚胎干细胞与来源于胚泡内细胞群的 ES 细胞相似，同样具有自我更新能力，多向分化潜能及无限增殖能力目前还没有人 EG 细胞移植治疗心肌梗死的报道因此本实验进行了体外培养的人胚胎生殖细胞植入大鼠梗死心肌部位的研究，希望最终能为心肌梗死治疗提供新的思路，为干细胞的临床应用奠定基础1 材料与方法1.1 主要试剂 DMEM 培养基 （GIBCO/BRL 、高糖）、胎牛血清（fetal calf serum , FCS , Hyclone）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF , R&D 公司）、白血病抑制因子（LIF，R&D 公司）、培养液 A：DMEM 液（高糖）+15%胎牛血清+0.1 mol/Lβ-巯基乙醇+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 U/ml 青霉素+100 U/L 链霉素、培养液 B：DMEM 液（高糖）+15%胎牛血清+0.1 mol/Lβ-巯基乙醇+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 U/ml 青霉素+100 U/L 链霉素 +1000 U/ml hLIF +1 ng/ml bFGF[30]、胰蛋白酶（Sigma）及 EDTA、MAB-1281（小鼠抗人细胞核单克隆抗体，CHEMICHON）、正常山羊血清 （博士德公司）、EnVision检测试剂盒（GK500705，Gene Tech, 盒中包括通用型二抗，DAB 及稀释液）。

1.2 胚胎来源 收集苏州大学附属第二医院妇产科，苏州市妇幼保健中心人工中止妊娠的 5~10 周人胚，每例胚胎均经孕妇和道义委员会同意，胚胎需完整，无严重污染1.3 人 EG 细胞的原代培养 取 5~10 周流产胚胎，在流产后 6 h 内，于超净工作台内，用含双抗（400 U/ml 青霉素、400 U/ml 链霉素）的无Ca2+、Mg2+的 PBS 冲洗胚胎，将胚胎移入无菌培养皿，打开胚体体腔，去除内脏，将背侧肠系膜及两边的生殖嵴从胚体背侧撕下，用含高浓度双抗的无菌PBS 冲洗组织块数次，将取出的组织切成 1 mm3 左右的小块将切碎的组织块移入 4 个培养瓶内，两瓶滴加少量培养液 A， 两瓶滴加少量培养液 B于 37 ℃、5%CO2 条件下培养，24 h 后加入足量培养液以后每 2 天半量换液，每日于倒置显微镜下观察细胞生长状态1.4 人 EG 细胞的传代培养 挑选细胞已铺满瓶底的培养瓶，弃去瓶内培养液，用 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 溶液 1~2 ml 消化细胞，2~4 min 后，镜下观察，当人 EG 细胞集落开始分散形成由数个细胞组成的细胞团时，加入 3 ml 与原培养液相同的 A 或 B 培养液终止消化。

用吹管将细胞吹打成单细胞悬液，吸出一半移入另一个培养瓶，于 37 ℃、5% CO2 条件下培养，次日换液追踪观察传代细胞的生长状况1.5 移植细胞的制备 移植前 1 h，以无菌接种针挑取传代培养至第 4代人 EG 细胞集落，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化[3]，待细胞发生胞质回缩，细胞集落分散开时，即加含血清培养基终止消化，用吸管反复轻轻吹打瓶底，使细胞成为均匀的单细胞悬液，用无菌 PBS 离心洗涤 2 次，将细胞吹打均匀，计数板计数，调密度至 1×106／ml以微量注射器吸取 50 μl，置 4 ℃待用1.6 实验动物分组及心肌梗死模型制作 将体重 200~250 g SD 大鼠 40只随机分为 2 组：（1）急性心肌梗死+人 EG 细胞（AMI+hEGcs, n=28）;大鼠心肌梗死后在梗死区边缘分四点注射各点注入 12 μl 细胞悬液；（2）急性心肌梗死对照组（AMI+PBS，n=12）：大鼠心肌梗死后在梗死区边缘分 4 点注射各点注入 12 μl PBS具体步骤参照文献[4]建模成功后即在心肌梗死区边缘用微量注射器分 4 点注射，各点注入 12 μl 人 EG 细胞悬液，密度为1×106／ml，对照组以同样方法注入等量的无菌 PBS。

关胸，维持辅助呼吸至自主呼吸恢复，送回笼中饲养术后肌肉注射青霉索 40 U 以预防感染，并在30 ℃条件下苏醒全手术过程为无菌操作，术后不需拆线1.7 免疫组织化学法鉴定 移植后 1 d、1、2、4 周，分别取 7 只移植组和 3 只对照组大鼠，用 4%水合氯醛腹腔注射麻醉，取出心，PBS 冲洗血液，去除左右心房和右心室，将左心室部位用 4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，石蜡切片采用二步法进行免疫组织化学标记，一抗分别为鼠抗人细胞核单抗（1∶100，MAB1281），二抗为通用型二抗，显微镜下观察实验严格按照说明书进行操作2 结 果2.1 人 EG 细胞在培养液 A 中的生长状态 组织块培养 24 h 后，有少量单个的人 EG 细胞及胚胎成纤维细胞游离出组织块，人 EG 细胞为圆形，核圆，核质比高，折旋光性强；人胚胎成纤维细胞为梭形或多边形，贴壁生长（图1A）培养 48 h 后，人 EG 细胞及人胚胎成纤维细胞均增多，人 EG 细胞 3~5 个聚集在一起，形成小的细胞团（图 1B）培养 8 d 可见单个人 EG 细胞明显减少，组织块周围出现圆形或椭圆形的正在形成中的人 EG 细胞集落，集落边缘尚不清晰，集落里细胞密集，细胞间界限不清；人胚胎成纤维细胞铺满瓶底（图1C）。

传代后，24 h，单个人 EG 细胞与人胚胎成纤维细胞混合生长，48 h 后，任成纤维细胞生长旺盛，人 EG 细胞开始聚集成有 10~15 个细胞组成的细胞团（图 1D）传至第 4 代人 EG 细胞集落明显变小（图 1E）2.2 人 EG 细胞在培养液 B 中生长状态 组织块培养 24 h 后，较多人EG 细胞及人胚胎成纤维细胞游离出组织块（图 2A） 培养 48 h，人 EG 细胞增殖旺盛，并形成由 6~9 个细胞构成的细胞团（图 2B）培养 6 天，单个人 EG细胞减少，组织块周围出现较多人 EG 细胞集落，集落呈圆形或鸟巢状，边缘清晰，人胚胎成纤维细胞铺满培养瓶底（图 2C）传代后 24 h，人 EG 细胞单个散在分布，可见少量胚胎成纤维细胞48 h，人 EG 细胞生长旺盛，聚集成10~15 个人 EG 细胞构成的细胞团块（图 2D）传至第 4 代，人 EG 细胞集落大小同前（图 2E）。