酶标（elisa）综述.pdf

酶标（ELISA）综述张传锋ELISA的发展ELISA是酶联接免疫吸附剂测定 ( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称自上世纪70年代初问世 以来，发展十分迅速，目前已被广泛用 于生物学和医学科学的许多领域ELISA技术原理1 .抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记2 .结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性3 .酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性4 .受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应再加入酶标记 的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上5 .此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例6 .加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量 与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定 性或定量分析测定方法具有很高的敏感度（p g - n g / m l 水 平），并且重复性好 以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶 对底 物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验 技术ELISA的方法1.检测抗体的间接法2.双抗原/抗体 夹心法3.检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法酶标的实验设计方法比较多，但是最常使 用 比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA 间 接法ELISA 检测方法1.Abs （吸收光）检测法2.荧光检测法?荧光强度（FI）?荧光寿命（FL）?荧光偏振（FP）?荧光共振能量转移（FRET）3.发光检测法?化学发光?生物发光 其中 发光有分为 快速发光法（闪光法）、慢速发光法（辉光法）技术要点1.试剂的制备、材料的准备2.反应条件的选择3.操作的标准化试剂及材料的准备ELISA的主要试剂有1.固相的抗原或抗体2.酶标记的抗原或抗体3.与标记酶直接关联的酶反应底物固相载体E L I S A 反应中最常用的固相载体为聚苯乙烯材料，聚苯乙烯 具有较强的吸附蛋白质的性能。

抗体或蛋白质抗原吸附其上 后保留原来的免疫活性，聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式 在E L I S A 测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反 应 抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面， 这包括通过疏水键、流水/离子键的被动吸附,通过引入其它 活性基团如氨基和碳基的共价结合，以及通过表面改性后的 亲水键结合酶标板• 高结合力酶标板(High Binding ELISA Plate): 经表面处理后蛋白结合能力大大增强,可达到400- 500ng IgG/cm2,主要结合的蛋白分子量 >10kD.使用该类板可提供敏感性,并可相对减少包被蛋白的浓度和用量,不足之处为较易产生 非特异性反应.抗原或抗体包被后,以非离子去污剂无法有效地封闭未结合的部位,需使用蛋白 作为封闭剂. • 中结合力酶标板(Medium Binding ELISA Plate): 经表面硫水键被动与蛋白结合,适合作为分子量>20kD的大分子蛋白的固相载体,其 蛋白结合能力为200- 300ng IgG/cm2.由于该类板所具的仅与大分子结合的特性,适 用于作为未纯化抗体或抗原的固相载体,可降低潜在的非特异性交叉反应.该类板可 以惰性蛋白或非离子去污剂作为封闭液. • 氨基化酶标板(Aminated ELISA Plate): 经表面改性处理后拥有带正电荷的氨基,其疏水键由亲水键取代.该类酶标板适合作 为小分子蛋白的固相载体.使用合适的缓冲液和pH值,其表面可通过离子键与带负电 荷的小分子结合.由于其表面的亲水特性和可通过其它交联剂共价结合的能力,可用 于固定溶于Triton- 100、Tween 20等去污剂的蛋白分子.该类板的缺陷为由于降低 了疏水性,一部分蛋白分子无法结合;此外,其表面需有效的封闭.由于亲水和共价的 表面特性,使用封闭液必须能够与非反应性氨基集团和所选择的交联剂中任何官能 基团如succinimide、aldehyde和maleimide发生作用。

聚氯乙烯聚氯乙烯与聚苯乙烯是类似的塑料，也可 作 为ELISA固相载体，聚氯乙烯板的特点为质 软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚 苯 乙烯板聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比 聚 苯乙烯高，但空白值有时也略高UV分析板(紫外光分析板)聚苯乙烯和聚氯乙烯板在紫外区有很强的吸收不 能 用于蛋白核酸的定量Uv分析板可直接读取核酸及蛋白的浓度?在260nm/280nm低本底干扰?UV板价格昂贵一般在150RMB左右抗原和抗体抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素本法要 求所 用抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强天然抗原（天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物 等，一般含有多种抗原成分，需经纯化，提取出特定的抗原成分 后才可应用，因此也称提纯抗原（purifiedantigen） ）?重组抗原?合成多肽抗原 （重组抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均为人工合成品，使用安全，而且纯度高，干扰物质少抗体?多克隆抗体?单克隆抗体抗血清成分复杂，应从中提取I g G 才可用于包被固相或酶标记含单 克隆 抗体的小鼠腹水中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接 进行 包被。

制备酶结合物用的抗体的质量往往要求有较高的纯度经硫 酸铵 盐析纯化的I g G 可进一步用各种分子筛层析提纯也可用亲和层析法 提纯 特异性I g G ，如用酶消化I g G 后提取的F a b 片段，则效果更好包被固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂将抗原或抗体固相化的过程称 为包 被（coating）1.抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为pH9.6的碳酸缓冲液） 2.加于ELISA板孔中在4℃过夜 3 .包被后再用1 ％～5 ％牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰这一过程称为封闭（b l o c k i n g ） （封闭为可选步骤， 有利于降低本底值4 .包被好的E L I S A 板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活 性酶和底物1.纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰 富、价格不贵2.制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分 和 催化能力3.受检标本中最好不存在与标记酶相同的酶4.相应底物应易于制备和保存，价格低廉5.有色产物易于测定，光吸收高ELISA常用酶辣根过氧化酶（HRP）1.HRP在蔬菜作物辣根中含量很高2.是一种糖蛋白，含糖量约18％；分子量为44kD。

3.是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合 而成的一种卟啉蛋白质4 .主酶为无色糖蛋白，在2 7 5 n m 波长处有最高吸收峰；辅基是深 棕色的含铁卟啉环，在4 0 3 n m 波长处有最高吸收峰HRP的反应原理HRP催化下列反应：上式中DH2为供氢体，H2O2为受氢体HRP对受氢体的专一 性很高，除H2O2外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过 氧化物后者为固体，作为试剂较H2O2方便许多化合物可作 为HRP的供氢体，在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺 （orthopenylenediamine，OPD）、四甲基联苯胺（3，3＇， 5，5＇- tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS[2，2＇- azino- bis(3- ethyl- benzthiazolinesulfonate- 6)]常用的酶反应底物1 .O P D （邻苯二胺）为在E L I S A 中应用最多的底物，灵敏度高，比 色方便缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性2 .T M B （四甲基联苯胺）没有O P D 的缺点T M B 经酶作用后由无色 变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色 计中定量；因此应用日见增多。

3 .A B T S （2 , 2 ‘- 连胺基- 2 ( 3 - 乙基- 并噻唑啉磺酸- 6 ) 铵盐 ），虽 然灵敏度不如O P D 和T M B ，但空白值很低OPD反应原理HRP催化OPD的反应如下：HRP纯度、活力指标H R P 的纯度用R Z （R e i n h e i t Z a h l ，意为纯度数）表示，是 4 0 3 n m 的吸光度与2 8 0 n m 的吸光度之比，高纯度的H R P 的 R Z ≥3 . 0 应注意的是酶变性后，R Z 可不变而活力降低， 故 重用酶制剂时更重要的指标为活力酶活力以单位表示： 1 m i n 将1 μm o l 的底物转化为产物的酶量为1 个单位碱性磷酸酶 （AP）?大肠杆菌提取的A P 分子量为8 0 k D ，酶作用的最适p H 为 8 . 0 小牛肠粘膜提取的A P 分子量为1 0 0 k D ，最适p H 为9 . 6 硝基苯磷酸酯（p - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e ，p - N P P ）作 为底物它可制成片状试剂，使用方便产物为黄色的对硝基酚，在4 0 5 n m 有吸收峰。

用N a O H 终 止酶反应后，黄色可稳定一段时间HRP与AP比较1.AP系统的其敏感性一般高于HRP系统， 空白值也较低2.由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较 HRP低3.AP价格较HRP高4.制备酶结合物时AP得率较HRP低等5.国内在ELISA中一般均采用HRP其它酶及比较酶标结合物酶标记的抗原或抗体称为结合物（c o n j u g a t e ）抗原由于化学结构 不 同，可用不同的方法与酶结合如为蛋白质抗原，基本上可参考抗 体酶 标记的方法制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种戊二醛交联法 戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或 其他抗原的氨基通过它而偶联过碘酸盐氧化法只用于H R P 的交联工作浓度在E L I S A 测定中，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予 以选择，以达到最合适的测定条件和节省测定费用 （一）间接法测抗体 1 ．酶标抗抗体工作浓度的选择 （1 ）用1 0 0 n g / m l 人I g G 进行包被，洗涤 （2 ）将酶标抗人I g G 用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的 孔中，保温、洗涤 （3 ）加底物显色加酸终止反应后，读取吸光度（A ），绘制曲线如 图1 5 - 1 0 。

读取A 值在1 . 0 时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的 工作浓度该酶标抗人I g G 的工作浓度应为1 / 1 6 0 0 棋盘滴定法选择包被抗原工作浓 度（1 ）用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤 （2 ）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清 用稀释液作1 : 1 0 0 稀释，加样，保温，洗涤 （3 ）加按工作浓度稀释的酶标抗人I g G 抗体，保温，洗涤 （4 ）加底物显色加酸终止反应后读取A 值 （5 ）选择强阳性参考血清的A 值为0 . 8 左右、阴性参考血清的A 值小 于0 . 1 的包被抗的的稀释度作为工作浓度夹心法测抗原在夹心法E L I S A 中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工 作 浓度夹心ELISA包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择1.抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和 0.1μg/ml，分别在ELISA板上进行包被，每一浓度包括 三个纵行，洗涤2.在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加 入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，保温，洗 涤3.将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:1000、 1:5000和1:25000。

分别加入每一包被浓度的一个纵行 中，保温，洗涤4.加底物显色加酸终止反应后，读取A值5.以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1 的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工 作浓度从上表可看出包被抗体浓度可选用1μg/ml，酶 标抗体的稀释度可选为1:5000为了进一步节省试剂， 。