透明质酸钠原料病毒灭活-去除工艺的研究.doc

透明质酸钠原料病毒灭活-去除工艺的研究.1126.安徽医药 AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2010Oct;14(10)◇药学研究◇透明质酸钠原料病毒灭活/去除工艺的研究任彩霞,范素俊,侯永泰(上海昊海生物科技股份有限公司,上海 201613)摘要:目的对鸡冠来源的透明质酸钠病毒灭活/去除工艺进行验证.方法根据生产所用鸡冠确定其可能携带的病毒种类,选择呼肠孤病毒Ⅲ型,伪狂犬病毒,水泡性口炎病毒和猴空泡病毒 40 作为相关的指示病毒.对透明质酸钠原料的制备工艺进行分析,确定透明质酸钠原料制备工艺中加热灭活工艺作为可能灭活/去除病毒的工艺,并进行病毒灭活/去除效果的验证.结果呼肠孤病毒Ⅲ型,伪狂犬病毒,水泡性口炎病毒和猴空泡病毒 40 经加热灭活处理的平均灭活对数值分别为≥5.688,≥5.375,≥6.542,≥7.125.透明质酸钠加热灭活工艺可有效灭活病毒.结论透明质酸钠加热灭活工艺可作为透明质酸钠制备过程中灭活病毒工艺,能有效保证产品的安全性.关键词:透明质酸钠原料;病毒灭活/去除;验证Heatinactivation/removalprocedureofhyaluronatesodiumvirusesRENCai.xia.FANSu-jun.H0UYong—tai(ShanghaiHaohaiBiologicalTechnologyCo.,Ltd,Shanghai201613,China)Abstract:AimToverifytheinactivation/removalprocedureofvirusesinhyaluronatesodiumderivedfromcockscomb.MethodsRe—ovMdae 一 3(Reo-3),pseudo—rabiesvirus(PRV),vesicularstomatitisvirus(VSV)andsimianvirus40(SV40)werechosenasiudica-torsforanalyzingthepreparationprocedureofhyaluronatesodium.Itisconcludedthatheat—inactivationisaneffectivemethod.Theeffi—ciencyofvirusesinactivation/removalwasverifiedaswel1.ResultsHeat—inactivationiseffective.Theaveragelogarithminactivationvalue(LIV)ofReo 一3,VSV,PRVandSV40areabove5.688,5.375,6.542,7.125,respectively.ConclusionrerpectiodyHeat—inacti—vationcanbeusedasaneffectivewaytoinactivate/removevirusesduringtheprocedureofhyaluronatesodiumproductionfromcocks—comb,inwhichtheproductsafetycanbeensured.Keywords:hyaluronatesodium;heatinactivation/removalvirus;verification透明质酸钠(HA)是由动物组织鸡冠提取的天然阳离子多聚糖,是由 D 一葡萄糖醛酸和 N 一乙酰氨基葡萄糖交替排列构成的长链高分子,具有良好的亲水性,黏弹性,润滑性".以鸡冠提取法生产的透明质酸钠(HA)生物相容性好,其制剂医用透明质酸钠凝胶已广泛应用于临床.为保证制品的安全性,既要控制原材料的质量,又要在生产过程中增加病毒灭活/去除工艺,以保证其安全性 .目前常用的病毒灭活/去除方法有:巴氏德消毒法,干热法,有机溶N/去污剂处理法,膜过滤法,低 pH 孵放法.动物源性原体(病毒和细菌)感染人类的风险性和潜在医源性感染显得日益突出.世界卫生组织进行了相关规定 J,我国国家食品药品监督管理局在 2002 年制定了《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》L4J.2009 年 2 月制定了《动物源性医疗器械产品注册申报资料撰写指导原则》,明确了一股将病毒感染性滴度减少~>41og 的处理步骤认可为有效的病毒去除/灭活工艺步骤.本文根据国家相关指导原则,对灭活方法,指示病原体的选择及医用透明质酸钠病毒灭活/去除工艺是否为有效的病毒去除/灭活工艺步骤进行了研究和验证.1 材料1.1 病原体灭活/去除验证用样品透明质酸钠原料是由鸡冠经绞碎后加热灭活(巴氏德消毒法,因后工序去酯,将温度提高至 80—90oC,2h±15min),去脂,酶消化,过滤,CPC 沉淀,乙醇沉淀,再经除菌过滤后脱水干燥制备而得.根据生产制备工艺,选择生产过程中加热灭活处理前的医用透明质酸钠溶液作为病毒灭活/去除验证用样品.1.2 指示病毒病毒的选择参照《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》结合医用透明质酸钠生产的具体工艺选择如下 4 种病毒:①呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3): 属呼肠病毒科,为双股 RNA 病毒,无囊膜,在 pH2.2～8.0 稳定,对有机溶剂有抵抗力,较耐热.②伪狂犬病毒(PRV):属疱疹病毒科,为双股 DNA 病毒,有囊膜,对乙醚,氯仿等脂溶剂,福尔马林和紫外线照射等敏感,是疱疹病毒中抵抗力较强的一种.③水泡性口炎病毒(VSV):属弹性病毒科,为单股负链 RNA病毒,有囊膜,可见光,紫外线及脂溶剂能使其灭活,不耐酸.对理化学因子的抵抗力与口蹄疫病毒相似.④猴空泡病毒40(SV40):属乳多空病毒科,为双股 DNA 病毒,无囊膜,对酸,热,乙醚,甲醛等均有较强的抵抗力.2 方法2.1 病毒灭活工艺选择根据病毒的理化特性,结合透明质酸钠的制备工艺,确定病毒灭活的关键工序:(1)加热灭活:纯蒸汽加热至 9O℃,维持 80～90℃,2h±15min,(2)CPC 沉淀.病毒滴度测定方法:96 孔细胞病变法,将分装好的病毒液接种于长满单层细胞的 96 孔板,第一列每孔加病毒上清液20l 作 10 稀释,此后依次作倍比稀释,每稀释度接种 8 孔,最后 l 列作阴性对照.置 37~C,5%CO 培养箱巾培养待细胞病变稳定后,观察记录结果,按 Karber 法计算 TCID50,每批样安徽医药 AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2010Oct;14(10)?1127?品重复测定二次.2.2 呼肠孤病毒Ⅲ型的灭活效果验证指示病毒及其培养病毒滴度:7.625LgTCID50/O.1ml,一 70~(2 保存备用 ;培养用细胞:BSC 一 1;滴定方法:96 孔细胞病变法.取三批中间品 (生产过程中加热灭活处理前的透明质酸钠溶液,2—8℃保存)各 9ml,分别加入 1ml 指示病毒液,混匀后取出 1ml,除菌过滤,作为零点对照样品.将剩余样品一病毒混合液于 88~C 水浴加热 2h,分别于 1 和 2h 取出 4ml,除菌过滤,作为处理后样品.分别滴定 TCID50,每批样品重复测定二次,见表 1.表 1 医用透明质酸钠中间品加热灭活工艺处理后灭活呼肠孤病毒Ⅲ型结果样品经 88℃加热处理壁垒里堕垦兰090622090707090714注:病毒去除数值为零点对照样本与 88~C 加热处理后样本检测值之差验证结果表明:三批透明质酸钠中间品进行加热灭活工艺处理后,可灭活呼肠孤病毒Ⅲ型.2.3 伪狂犬病毒的灭活效果验证指示病毒及其培养病毒滴度:7.750LgTCID50/0.1ml,一 70"12 保存备用;培养用细胞 :PK 一 15;滴定方法 :96 孔细胞病变法.取三批中间品各 9ml,分别加入 1ml 指示病毒液,混匀后取出 1ml,除菌过滤,作为零点对照样品.②将剩余样品一病毒混合液于 88~C 水浴加热 2h,分别于 1 和 2h 取出 4m1,除菌过滤,作为处理后样品.结果见表 2.表 2 透明质酸钠中间品加热灭活-r 艺处理后灭活伪狂犬病毒结果样品经 ss℃加热处理—鲁墅鲁蓦注:病毒去除数值为零点对照样本与 88oC 加热处理后样本检测值之差验证结果表明:三批透明质酸钠中间品加热灭活工艺处理后,可灭活伪狂犬病毒.2.4 水泡性口炎病毒的灭活效果验证指示病毒及其培养病毒滴度:8.125LgTCID50/0.1ml,一 70~C 保存备用 ;培养用细胞:Vero;滴定方法:96 孔细胞病变法 .取三批中间品各 9ml,分别加入 1m1 指示病毒液,混匀后取出 1ml,除菌过滤,作为零点对照样品.②将剩余样品一病毒混合液于 88~C 水浴加热 2h,分别于 1 和 2h 取出 4ml,除菌过滤,作为处理后样品.病毒滴定方法:通过 96 孔细胞病变法,计算按 Karber 法.每批样品重复测定二次.验证结果见表 3.2.5 猴空泡病毒 4O 病毒的灭活效果验证指示病毒及其培养病毒滴度:8.875LgTCID50/0.1ml,一 70~C 保存备用 ;培养用细胞:Vero;滴定方法:96 孔细胞病变法 .取三批中间品各 9m】,分别加入 1ml 指示病毒液,混匀后取出 lml,除菌过滤,作为零点对照样品.将剩余样品一病毒混合液于 88~C 水浴加热 2h,分别于 1 和 2h 取出 4ml,除菌过滤,作为处理后样品.每批样品重复测定丽次.结果见表 4.表 3 医用透明质酸钠中间品加热灭活工艺处理后灭活水泡性口炎病毒结果样品经 88℃加热处理堡塑竺旦壁!:!1090622090707090714注:病毒去除数值为零点对照样本与 88℃加热处理后样本检测值之差验证结果表明:三批透明质酸钠中间品进行 88~C 加热处理后,可灭活水泡性口炎病毒.表 4 透明质酸钠中间品经加热灭活工艺处理灭活猴空泡病毒 40 病毒结果样品经 88℃残余猴空泡病毒 40 病毒滴度(LgTCIDS0/0.1m1)加热处理 090622090707090714注:病毒去除数值为零点对照样本与 88"12 加热处理后样本检测值之差验证结果表明:三批透明质酸钠中间品进行加热灭活工艺处理后,可灭活水泡性口炎病毒.2.6CPC 沉淀处理工序病毒灭活的验证选择上述四种病毒为指示病毒,取生产过程中 CPC 沉淀之前的中间品,感染水泡性口炎病毒,猴空泡病毒 40,呼肠孤病毒Ⅲ型和伪狂犬病毒等四种指示病毒后按照其生产工艺,进行 CPC 沉淀处理,病毒去除量小于 4logs,根据国家食品药品监督管理局在2002 年制定了《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》的规定,CPC 沉淀处理灭活病毒无效.3 结果本次试验用的三批透明质酸钠中间品,感染呼肠孤病毒Ⅲ型,伪狂犬病毒,水泡性口炎病毒,猴空泡病毒 40 四种指示病毒后,按照透明质酸钠生产工艺,进行加热灭活处理,病毒去除量均大于 4togs,故该工艺为有效灭活病毒的方法,进行CPC 沉淀处理,病毒去除量小于 4logs,故 CPC 沉淀处理灭活病毒无效.根据 2005 年 12 月药品审评中心制定了《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》,指导原则指出,对于生物组织提取制品应包含两种从机制上能够互补的有效工艺步骤,至少一个处理步骤应具有针对非脂包膜病毒的去除和/或灭活效应,通过上述两步病毒灭活工艺步骤验证,加热灭活处理,病毒去除量均大于4logs,为有效病毒灭活工艺,符合国家相关规定.4 讨论.'随着动物源性组织,细胞,体液及重组真核细胞表达制备的制品逐渐增多,动物源性产品原材料质量控制已引起人们的足够重视,参照《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》,结合动物源性生物制品的特殊要求,应首先选择来源动物携带的人畜共患相关病毒作为指示病毒,不能用相关病毒的,应选择其理化性质尽可能相似的指示病毒,此外还应根据。