表面等离子体共振仪器讲解.ppt

表面等离子体共振表面等离子体共振 ————仪器介绍仪器介绍2021/6/161表面等离子体共振仪就是应用表面等离子体共振仪就是应用 SPR SPR 原理检测生物传感芯片原理检测生物传感芯片（（biosensor chipbiosensor chip）上配位体与分析物之间的相互作用情况）上配位体与分析物之间的相互作用情况. .2021/6/162下面以瑞典的Biacore3000 型 SPR 仪（右图所示）为例，简要介绍这种仪器的构成及工作原理2021/6/163仪器的主要构造uBiacore3000由工作单元和一台安装有 Biacore Control 软件的电脑组成u工作单元的核心部件包括光学系统、传感器芯片、液体处理系统三个主要部分u其他的组成部分包括LED状态指示器及温度控制系统等u其中，传感器芯片是最为核心的组件：传感器芯片提供了产生SPR信号的必需物理条件，并且分子相互作用的研究是在传感器芯片表面进行的2021/6/164一、光学系统u 其所利用的生物大分子相互作用分析（Biomolecular Interaction Anaylysis） 技术是基于表面等离子共振(SPR)的物理光学现象的新型生物传感分析技术.u由于其不必使用荧光标记和同位素标记，从而保持了生物分子的天然活性。

u SPR共振角会随金属薄膜表面通过的液相的折射率的改变而改变，折射率的变化（RU）又与结合在金属表面的生物大分子质量成正比具体 1000RU 的变化表示传感片表1ng/mm的质量变化）u 因此，BlA 技术可以通过对反应全过程中各种分子反射光的吸收获得初始数据，并经相关处理获得结果2021/6/165u用 SPR 检测器所得的信息可直接来自表面的样品，也可间接来自能与样品特异结合的相关试剂，还可以从粗样品的嘈杂信号中获得微量待测样品的特异性信号 其最低检测下线为 pg 级 (10-12g)2021/6/166二、传感器芯片（sensor chip）u在 BIA 技术中必须首先有一个生物分子偶联在传感片上，然后用它去捕获可与之进行特异反应的生物分子u将 50nm 至 100nm 厚的金膜固定在一块玻璃片上，将此玻璃片嵌在一个塑料平板夹里，用一种折射率与棱镜匹配的聚合物将芯片耦合到玻璃棱镜上，在芯片表面固定一层较容易与其它生物大分子偶联的葡聚糖分子层（使用者也可以根据需要选择非葡聚糖分子层的芯片）而成该偶联过程可由仪器全自动控制 最为核心的部件2021/6/167传感器芯片光波导耦合器件金属膜分子敏感膜2021/6/1681 1、光波导耦合器件、光波导耦合器件u产生SPR现象必须将光波（消逝波部分）与表面等离子体波耦合并使其发生共振，因此需要使用耦合器件。

耦合器件棱镜型光栅型光纤型光波导型2021/6/1691.1、棱镜型u用于产生衰减全反射的棱镜型装置有Otto结构和Kretschmann结构，二者在结构上的区别主要是棱镜底面与金属膜之间是否存在间隙Otto型结构对此间隙的取值有严格要求，在制作和使用上都有一定难度，因此应用的比较少；Kretschmann型结构简单，制作容易实现且使用方便，较容易达到很高的灵敏度，因此应用也最为广泛，是SPR传感装置最常用的结构对于Kretschmann结构来说，由于渐逝波需要穿透金属层，在与被测物接触的表面激发才能产生表面等离子体波，因此对金属膜的厚度有严格的限制2021/6/16101.2、光栅型u在光栅的表面覆盖一层金属膜，金属膜与分析溶液接触，当入射光照射在光栅表面时，反射光将出现散射，如上图，当某一阶(m=0，±1，±2，…)的动量与表面等离子体波的动量相等时，二者发生共振2021/6/16111.3、光纤型u光纤型SPR传感器采用光纤作为光的传输媒介，主要有两种形式：终端反射式和传输式，其结构如下图所示由于光纤的独特性质，加上这种SPR传感器的结构紧凑、小巧，很容易实现微区探测、遥测和分布式检测。

目前影响光纤型SPR传感器的主要问题是制作工艺复杂，成本高2021/6/16121.4、光波导型u 光波导型SPR传感器的原理与棱镜型十分相似，如下图所示，不同之处在于光波传输的媒介由棱镜变为光波导，在理论上，它可达到的检测精度也与棱镜型的相仿所谓的光波导是光波传导的材料，能把光束缚在一定区域内传播光波导型SPR传感器有其自身的优点：光波的传输途径可以人为控制；易于实现微型化；稳定性好等2021/6/16132 2、金属膜、金属膜u金属元素的性质各不相同因此，选择不同种类金属材料作为构成表面等离子体共振的基质膜，将会对 SPR 光谱产生很大影响SPR 研究的是反射光谱，所以需要在可见光范围内考虑反射率较高的金属，其随波长变化而改变的幅度较小，稳定性要好故 Au 膜和 Ag 膜是 SPR 中最常使用的两种金属薄膜u从SPRSPR光谱的三个特征参数（共振波长，共振宽度，共振深度）来看，在同样的条件下，银膜的共振波长的变化明显比金膜灵敏，共振深度约大于金膜，共振峰宽明显小于金膜uAu 膜的稳定性最好，在 SPR 中具有重要应用价值，尤其适用于银膜不能使用的体系2021/6/1614u金属薄膜的厚度是影响共振深度的重要因素(见右图)。

随着膜厚度的增加，共振深度变小，最小反射系数变大；当膜厚度超过一定值时，共振峰将消失当膜厚在某一数值时，反射光强度近似为零，共振深度达到最大通过实验，一般选择膜厚度为 50nm 左右，最多不超过 100nm2021/6/16153 3、分子敏感膜、分子敏感膜u 为了满足分析各种生物体系的要求，多种传感器芯片应运而生，从各类小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸和寡聚糖直至类脂、噬菌体、病毒和细胞，每一种芯片都必须能提供给科学工作者稳定的基线，高灵敏度，广泛的再生方法，反复使用性和特别好的重现性成膜方法：1.金属膜直接吸附法2.共价连接法（生物素-亲和素、葡聚糖凝胶、水凝胶、高分子膜、多肽等）3.单分子复合膜法4.分子印膜技术2021/6/1616三、液体处理系统Biacore 3000的液体流路简图的液体流路简图 自动上样装置一体化U型射流器2021/6/1617四、温度控制系统uSPR 信号对于温度变化非常敏感，所以在整个实验过程中保持传感芯片表面的温度恒定是非常重要的Biacore 3000 采用 Peltier 元件来控制传感芯片的表面温度如果温度不稳定，仪器前部面板上的黄色 LED会不停的闪烁。

通过预先设定，实验者可以把温度控制在4-40℃之间任意一点 2021/6/1618五、LED状态指示器 u在仪器前部面板上有 5个 LED 状态指示器，LED的最显著特点是使用寿命长，光电转换效能高，分别能够显示仪器不同方面的状态 2021/6/1619u 另外，在光源的选择上，固定波长、改变入射角测量方式的 SPR 装置多采用 He2Ne 激光器(λ= 63218nm) 作为光源用激光器作光源，单色性好，强度高在部分文献中发光二极管(LED) 也作为 SPR 的光源，选择的波长多为 760nmLED 的单色性也较好，且体积小，价格低，使用寿命长 u 采用固定入射角以波长为变量测量方式的 SPR仪器和装置，白炽灯中的卤钨灯是较适合的光源，因为它在可见光区有连续发射光谱，并具有足够的强度和稳定性，强度不随波长而改变，使用寿命较长 六、光源2021/6/1620采用固定入射角改变波长工作模式的 SPR 装置示意图 检测过程电荷耦合器件2021/6/1621多谢多谢 !2021/6/1622 结束语结束语若有不当之处，请指正，谢谢！若有不当之处，请指正，谢谢！。