蛋白的分离和纯化-栗晓霞教学材料.ppt

1单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式蛋白质的分离和纯化 Isolation and Purification of Proteins营养与食品卫生 栗晓霞蛋白质的意义n蛋白质是各种生物有机体的重要组成部分是生命的物质基础之一机体的很多活性物质如酶、多肽激素、抗体、核蛋白都是蛋白质，它们参与重要的生命活动蛋白质也就成为揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象研究蛋白质首要步骤就是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到高纯度的有生物活性的目的蛋白因此高效的分离纯化技术是蛋白质研究的重要基础和关键之一 蛋白质的提取1.材料的选择原则n含较高质量的所需蛋白n来源方便2.组织细胞的破碎n 高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等 n玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织 n超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。

n反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎 n化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好蛋白的分离纯化方法n一 根据溶解度不同 n二 根据分子大小不同 n三 根据电离性质不同n四 根据配基特异性不同一 根据溶解度不同的分离纯化方法1.等电点沉淀n蛋白质在等电点时溶解度最小2.盐析沉淀常用的蛋白质沉淀方法n一定浓度的盐溶液（例如硫酸铵、氯化钠）可中和蛋白质的电荷以及水化膜受到破坏，影响了蛋白质的稳定性使蛋白沉淀3低温有机溶剂沉淀法常用的蛋白质沉淀方法n有机溶剂的介电常数比水低在一定量的有机溶剂中，蛋白质分子间静电引力增加，水化作用降低，促使蛋白质聚集沉淀n有机溶剂多为丙酮、乙醇n注意：对于蛋白质的沉淀一般要求低温条件下进行二 根据分子大小不同 的分离纯化方法1.透析和超滤n透析是利用蛋白质分子对半透膜的不可透过性而将不同蛋白质分开n此法简单，常用于蛋白质的脱盐，但耗时长n超滤是利用超滤膜在外力作用下，大分子物质被截留而小分子滤过排出。

该方法是根据分子大小和形状，在10-8 cm数量级进行选择性分离n常用于蛋白质溶液的浓缩、脱盐、分级纯化二 根据分子大小不同 的分离纯化方法2.分子排阻层析（分子筛层析、凝胶过滤）n其原理是利用不同分子量的蛋白通过具有分子筛性质的凝胶而被分离n分离次序：在层析洗脱时，大分子受阻小而最先流出，小分子受阻大而最后流出n常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶二 根据分子大小不同 的分离纯化方法3.密度梯度离心n蛋白质的沉降速度取决于分子大小和密度当其在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的沉降得快而且当蛋白沉降到与自身密度相等的介质梯度时，就停止不前，可分步收集进行分析n该法在离心中使用密度梯度具有稳定作用，可以抵抗由于温度变化或机械振动引起区带界面的破坏而影响分离效果三 根据电离性质不同的分离纯化方法1.电泳法n带电介质在电场中向电荷相反的方向移动这种性质叫电泳蛋白质是两性电解质，在不同PH条件下，所带的电荷质和量各异蛋白质移动的方向和速度主要取决于蛋白质所带的电荷性质、数量、质点的大小及形状三 根据电离性质不同的分离纯化方法n1.电泳法常用方法支持物特点实例运用醋酸纤维 薄膜电泳醋酸纤维 薄膜电泳效果比纸电 泳好，时间 短，电泳图谱 清晰血浆蛋白电泳分析聚丙烯酰 胺凝胶电泳聚丙烯酰 胺凝胶有电泳和凝胶过滤 双重特点，因此电泳分辨率高。

样品需要量少用于蛋白质分子量测定等点聚焦电泳两性电解质分辨率高用于蛋白质的分离纯化和分析免疫电泳琼脂或琼脂糖凝胶样品用量少特异性高分辨力强用于蛋白质（例如抗体）的鉴定及纯度的检查三 根据电离性质不同的分离纯化方法2.离子交换层析n原理：三 根据电离性质不同的分离纯化方法2.离子交换层析n离子交换纤维素n离子交换凝胶n大孔型离子交换树脂n普通离子交换树脂适用于小分子离子化合物的分离（例如氨基酸、多肽）适用于大分子物质的分离和纯化四 根据配基特异性不同的分离纯化方法亲和层析法（又叫选择层析、功能层析、生物特异吸附层析）n亲和力：蛋白质与其相对应的化合物（称为配基）所具有特异结合的能力n该方法的重要特性：n高度特异性 如抗体和抗原、酶与底物或抑制剂、RNA与互补的DNA之间都有高度的选择性n可逆性 例如抗原和抗体的反应，一般碱性时结合，酸性时解离n是一种具有高度专一性分离纯化蛋白质的有效方法 总结 蛋白质分离纯化技术策略n针对我们的研究目的不同，合理选择蛋白质分离纯化技术、方法n一种方法往往不能够很好地获得目的蛋白质，常常结合两种分离方法，更能够获得较理想的目的蛋白n分离蛋白质关键技术：主要是要有一个较好的检测手段，(灵敏、快速、简便和宜操作) 。