实验三1血清蛋白含量测定电子教案.ppt

单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*1动 物 生 物 化 学 实 验l实验三 血清蛋白含量测定一、 实验目的l学习光谱光度法测定物质含量的原理l掌握考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质 含量的基本原理和技术二、实验原理l1. 光谱光度技术原理 利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量吸光度与透光度 A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I 当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即：T = I/I0 T100为T%称为百分透光度透光度的负对数称为吸光度即：Lambert-Beer定律 Lambert指出： 当一定的光线（I0）通过呈色溶液时，如果溶液的浓度（C）是一定的，则透过光线的强度（I）随通过液层的厚度（L）的增加成指数函数的减少，即 I=I010-KLBeer指出：当液层厚度（L）一定时，透过光线的强度随吸收光线物质浓度（C）增加而成指数函数的减少，即： I=I010-KCI0Il合并上两式：l I=I010-KCLl取对数： -lgI/I0 = KCLlA(OD) = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I = KLC 式中A为吸光度或光密度（optical density),也可用OD表示；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度 l 故Lambert-Beer定律可表述为：当一单色光透过呈色溶液时，光密度或消光度与被测溶液的浓度，液层的厚度成正比；透光度的对数与其成反比。

l A(OD) = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I = KLC 据Lambert-Beer定律，当液层厚度单位为cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数() 的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时，在特定波长下的吸光度值是物质的特征性常数 A(OD) = LC2.分光光度法的定量分析l直接计算法： A(OD) =LC C = A/Ll标准管法 ： 对同一物质，在特定测定条件下， 是相同的常数 A(OD)标 = LC标 A(OD)未 = LC未C未= A(OD)未 / A(OD)标 C标l标准曲线法：COD 配制一系列浓度的标准品溶液，按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度u制作和应用标准曲线时应注意下面几点：（1）测定条件发生变化时（如更换标准品和试剂等），应重新 绘制2）标准品应有高的纯度，标准液的配制应准确3）当待测液吸光度超过线性范围时，应将标本稀释后再测定4）标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致。

3.分光光度计的基本结构最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计 光源单色器比色杯检测器显示器五大部份n结构：4.分光光度计的使用以721-B型分光光度计为例 （1）开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电20分钟使仪器预热l分光光度计的使用（2）将波长旋至测定的波长3）将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中l分光光度计的使用 （4）将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T为0.0,关上比色池盖子，调节T为100.0l分光光度计的使用（5）将开关置于A，用消光调零调节A为0.0l分光光度计的使用(6) 将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A）l分光光度计的使用 5.蛋白含量测定-染料结合法实验原理l 在酸性条件下，蛋白质分子可解离出带正电荷的 -NH3+，可同考马斯亮蓝G-250产生颜色反应，最大吸收为595nm，该方法操作简单，重复性好，最低测定值为1g 三、实验试剂：l1. 标准蛋白液：1mg/ml的牛血清白蛋白l2. 显色剂：100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml、95%乙醇中，再加入100ml磷酸，然后用蒸馏水稀释至1000ml。

l3. 样品液：稀释50倍的牦牛血清四、实验操作：l取试管3支，按下表操作试剂试剂 （ml）12（标标准）3（空白）牦牦牛血清（稀释释50倍）0.05标标准蛋白0.05H2O0.05显显色剂剂5.05.05.0 混匀，2分钟后，测定各管在595nm处的光吸收，计算蛋白含量五、实验结果及分析1.计算每100ml牦牛血清中含蛋白质多少克？2.2.分析实验结果。