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    基于高分子聚合物及毛细玻璃管的固态单纳米孔通道在分析化学中的应用    翟庆峰 李敬 汪尔康摘 要 纳米孔检测技术以其独特的优势在电分析化学领域引起广泛的关注，基于此构建的电化学传感器及电化学整流开关已被用于多种目标物分析，如单分子蛋白检测及DNA测序纳米孔既可由生物分子制成，也可由固态材料制备其中，固态纳米孔易于修饰，机械性能、稳定性等相对较好，应用较为广泛纳米孔检测技术主要的输出信号为电阻脉冲和电流-电压曲线（离子整流），本文以两种输出信号为重点，详细介绍了纳米孔检测的原理和应用，总结了近年来固态单纳米孔通道在分析化学领域的发展，并对该领域未来的发展趋势和应用前景进行了展望关键词 固态单纳米孔； 电阻脉冲； 离子整流； 传感器； 响应开关； 评述1 引 言生物医学的快速发展和实际需求为生物传感分析提出了新挑战，疾病早期诊断及复杂生物样品中的灵敏、准确检测的迫切要求促进分析化学传感技术由传统的定性与定量分析向更高的单分子水平檢测发展自库尔特计数器发明以来，随着单通道电流的记录技术及纳米微加工技术的日趋成熟，纳米孔检测技术以其独特的优势，如低成本、操作简单快速、高通量、实时、免标记等，已在分析化学领域获得广泛的关注和发展[1～3]。

基于纳米孔构建的电化学传感器已被广泛用于检测各种离子、生物分子、单分子蛋白及DNA，并有望成为第四代DNA测序的新技术[4，5]目前，基于纳米孔构建的电化学检测系统主要分为三类：蛋白质纳米孔、固态纳米孔及结合两者优势构建的杂化纳米孔蛋白质纳米孔包括α-溶血毒素（α-HL）、耻垢分枝杆菌毒素蛋白A （MspA）、噬菌体phi29连接器马达蛋白（Phi29 connector）等，蛋白质纳米孔的孔径精确、固定，相关文献报道展示了其在区分短的寡核苷酸片段及单链DNA方面的绝对优势[6，7]但是，蛋白质纳米孔本身所具有的局限性，如机械稳定性差、对实验条件（温度、pH值、盐浓度等）要求苛刻，限制了其广泛应用[8～10]相对于蛋白质纳米孔，以人工材料构筑的固态纳米孔，包括氮化硅、氧化硅、石墨烯以及有机高分子薄膜[11]，具备较好的机械强度、优异的化学稳定性和热稳定性，能够适应更加复杂的检测环境，还可重复使用，节约成本[12]固态纳米孔的形状和尺寸可调控，且能在其表面进行灵活的化学或生物修饰，能够用于多种复杂结构分子目标物的检测此外，其稳定的结构有助于与其它微型探测器和探针或分析电路相集成，构建更加灵敏的单分子检测的生物传感器[12，13]。

此外，杂化纳米孔的发展实现了生物孔和固态孔更好的优势结合，且避免了两者的缺点，对于单分子目标物的分析检测具有更大优势[14]目前开发的杂化纳米孔主要有α-HL与SiNx杂化的纳米孔[15]，将碳纳米管嵌入磷脂双分子层或者细胞膜构建的杂化孔[16]随着DNA折纸技术的发展，三维DNA折纸结构与固态纳米孔相结合构建的杂化纳米孔已见诸报道[17]本文结合固态纳米孔的独特优势和性能，总结了固态纳米孔检测的原理及在分析化学领域的应用，分别介绍了以电阻脉冲作为输出信号的固态纳米孔用于检测单分子DNA、蛋白质及提高检测性能的方法，对固态纳米孔以离子整流作为输出信号用于响应开关及电化学传感器的构建进行了概述2 电阻脉冲检测方法电阻脉冲检测方法具有原理简单、可实时监测及响应信号灵敏等优势，且电流信号经膜片钳系统检测、放大和转换后，易于读取和分析，是目前纳米孔分析技术最常用的检测手段[11，18]其工作原理如图1所示，在纳米通道两段施加恒电位，在电场作用下，电解质溶液中的离子流经通道，产生稳定恒电流（图1A）当电解质溶液中存在待测物时，待测物质能够在扩散作用和电压驱动下进入纳米孔，堵塞纳米通道，导致电流降低（图1B）。

当检测物完全离开孔道时，通道中的电解质状态还原，电流恢复初始值，相应的会出现一个电阻的脉冲峰（图1C）通过分析脉冲电阻图可以得到3个重要信息：阻塞脉冲电流、分析物滞留时间及阻塞脉冲频率通过对以上数据进行综合分析即可实现对检测物的定性和定量检测[19]单个分子/纳米颗粒造成纳米孔道尖端离子流的增强或减弱均会产生显著的离子流扰动信号，可用于获得待测物的结构、长度、表面电荷、振动动频率等信息[20，21]目前，基于该原理的检测方法常被用于单分子DNA的传感分析，其对纳米孔的尺寸要求比较严格，纳米孔的尺寸应尽量与目标检测物在溶液相中的动态尺寸相匹配，纳米孔的尺寸过大或过小均不能产生理想的电阻脉冲信号[22，23]另外，目标检测物在电压的驱动作用下穿过纳米孔的速度非常快，以目前的检测手段及仪器的精度和时间分辨率，对于实现单分子水平的检测仍然存在挑战，尤其是对DNA测序过程中单个核苷酸的分辨识别[8，14]通常可通过增加溶液的盐浓度、降低所施加的驱动电压或缩小纳米孔的尺寸，以降低目标物穿孔的速度，增强信噪比[24]例如，Xu等[25]开发了一种简单有效的缩小玻璃管纳米孔的尺寸的湿化学方法（图2A），通过硅酸盐的水解反应在纳米孔内壁形成SiO2层，纳米孔的尺寸缩小到<10 nm。

该方法简单有效，低消耗，对环境友好，并且不改变玻璃管纳米孔本身的特性尺寸缩小之后的纳米孔不仅降低了DNA的迁移速率，而且显著增强了DNA的迁移信号和信噪比另外，很多文献报道已经证实，在纳米孔表面进行适当的功能化修饰，不仅能够有效降低纳米孔对目标检测物的非特异性吸附，防止孔道堵塞，降低背景信号，也能够缩小纳米孔径提高检测效果[24]其原理主要依赖纳米孔表面功能化修饰的官能团能够对目标检测物产生相互吸引力（如氢键、范德华相互作用等），降低目标物的穿孔速度Crick等[26]在玻璃管纳米孔表面覆盖多层石墨烯，将纳米孔完全覆盖，通过原位电化学刻蚀，纳米孔由完全闭合转化为完全打开的状态，从而精确地制备具有任何孔径尺寸的纳米孔（图2B）在较小孔径尺寸下，能够有效降低DNA穿孔速率，提高检测效果此外，石墨烯表面具有较多的含氧基团，不仅对DNA迁移速率起调节效果，而且为纳米孔表面的功能化提供了良好平台尽管在纳米孔内表面进行功能化和缩小纳米孔的尺寸在降低目标物穿孔速度、提高选择性和灵敏性方面展现出了一定的优势，但是这些策略通常需要细致、繁琐的优化过程开发易于制作和功能化的免标记生物传感器，实现对单分子目标物（如核酸DNA和蛋白质）的检测仍然存在挑战。

最近的研究表明，在固态纳米孔道内嵌入一个门电极，提供一个局部的电场，可通过调控门电极的电压实现对目标检测物通过纳米孔的速度及迁移方向的有效控制[27，28]此外，研究人员还将场效应晶体管（FET）与纳米孔相结合，制备出具有离子效应的场效应管，其物理原理与传统的半导体场效应管相似，即通过栅极控制离子的流速，而非电子或者空穴该传感平台在提高选择性和控制目标物运输方面具有潜在优势例如，Ren等 ＼[29]通过在具有双孔的玻璃管纳米孔的一个孔道内填充碳，形成碳纳米电极，然后在玻璃管纳米孔表面沉积一层聚吡咯导电层作为门电极，构建了一个新的納米孔扩展的场效应晶体管（nexFET）如图3A所示，通过控制门电压，可有效控制DNA在单分子水平上通过纳米孔道，实现对其检测另外，聚吡咯栅层适合嵌入可用于选择性分子传感的人工受体，通过将胰岛素嵌入到聚吡咯导电层，实现了对抗胰岛素人类免疫球蛋白抗体的检测nexFET的显著优势是能实时调整纳米孔的离子运输特点，通过电聚合调整纳米孔的尺寸与分析物相吻合，在实现高通量检测的同时也可显著增强信噪比除此之外，该课题组同样基于两个孔道的玻璃管纳米孔，通过在其底部滴加一滴液滴形成纳米桥梁，将核酸DNA分子的转移限制在间隔为20 nm的两个纳米孔之间（图3B）[30]。

相对于传统的纳米孔检测方法而言，该方法使目标分子的移动速率能够降低约3个数量级，有效增强了对目标物检测的信噪比、分辨率、灵敏度，降低了检测限； 同时，该方法具有普适性，可以扩展用于双链DNA、RNA、单链DNA及蛋白质分子的检测最近，研究人员开始将纳米孔作为一种确定蛋白物理参数的强有力的分析工具，如蛋白的尺寸、构象状态、蛋白与蛋白之间的相互作用及与适配体和抗体作用的动力学等[31～33]但是，相对于DNA而言，蛋白质具有不同的尺寸、三维结构和不均匀的电荷分布，这些都对纳米孔技术检测蛋白质提出了挑战，尤其是对相似尺寸的蛋白质检测的弊端就是缺乏选择性解决以上问题主要有两种方法，第一种方法是在纳米孔表面修饰特异性的识别受体，蛋白质与受体特异性结合阻塞纳米孔[34，35]； 另一种方法是利用DNA作为载体分子分离和检测蛋白[33，36]Bell 等[37]通过DNA杂交将190个寡核苷酸（约7.2 kbp）组装形成线性的双链DNA作为载体，在特定位置设置与目标蛋白质结合的特异性结合位点，从而实现了对链霉亲和素的检测首先，将亲和素负载在双链DNA载体上，其中，1B、3B和5B分别对应着负载了1个、3个和5个亲和素位点，链霉亲和素通过特异性结合作用连接到DNA载体上。

将DNA载体置于纳米孔检测系统中，在电压的驱动作用下，DNA载体和蛋白的复合物进入纳米孔道由于结合的蛋白质分子位于DNA载体的中心位置，所以在离子电流轨迹中，蛋白质的特征电流峰信号清晰地出现在DNA信号中间另外，随着蛋白绑定位点数量增加，蛋白信号的振幅增大利用该纳米孔传感器实现了在混合体系中对目标蛋白的特异性灵敏检测最近，Lin等[38]采用溶菌酶适配体修饰的金纳米粒子为分子载体，在复杂体系下实现对溶菌酶的高选择性检测相对于目标蛋白而言，适配体修饰的金纳米粒子的引入有效增大了复合物的尺寸，降低了表面的电荷量，削弱了目标蛋白与纳米孔之间的相互作用，显著增强了目标蛋白穿孔频率及信噪比值得一提的是，以上的检测只能实现对单一目标蛋白分子的检测Bell 等[39]基于载体-蛋白复合结构的检测方法，提出了一种数字编码的纳米结构，实现了在复杂体系中对4种蛋白的同时检测在该工作中，在DNA载体中引入了纳米孔可识别的独特的条形码，当该DNA纳米结构通过固态纳米孔检测时，含有3个结构单元的条形码对其检测的准确性可达到94%选取4个条形码，在每个条形码的特定位置修饰对4种目标抗体具有特异性结合的绑定位点，将其用于混合体系中四种抗体蛋白的同时检测，很容易通过条形码的明显差异实现对4种抗体的检测和区分。

基于载体-蛋白的检测方法对蛋白质的检测和识别相对比较成熟和准确，但是这种DNA载体的设计和合成通常比较复杂，需要基因工程和DNA合成化学等除了用于单分子的DNA和蛋白质检测外，固态纳米孔作为一种强大的分析工具在其它应用方面也展现出了绝对的优势Chen等[40]利用单个的玻璃管锥形纳米孔作为一个模型系统模拟研究了单膜磷脂囊泡迁移的动力学，囊泡依次动态通过纳米孔，可通过周期性出现的离子动态阻塞电流信号进行直观的观察另外，通过调控纳米孔的尺寸、溶液pH值、囊泡浓度、施加的电压及纳米孔内表面的荷电性所引起的离子电流阻塞信号振幅和滞留时间的变化，实现对单膜磷脂囊泡迁移行为的系统研究该课题组还利用纳米孔分析技术在完全均质的条件下实现了对单分子DNA组装结构的表征[41]他们以DNA杂交链反应（HCR）和催化发卡组装（CHA）反应为例，基于纳米孔分析技术的超灵敏特性，实现了对所形成的DNA纳米结构的表征当形成的DNA串联体通过纳米孔时，其在孔道内的滞留时间能够提供所形成的DNA串联体的精确的长度和折叠信息与原子力显微镜分析技术相比，纳米孔分析技术可通过对其穿孔事件进行计数和分析实现对单个的串联体信息的检测； 与凝胶电泳相比，可通过电流降低的幅度和滞留时间实现对形成的DNA串联体的大致长度和结构信息的表征，其超灵敏的检测性同样可以揭示被凝胶电泳及其它分析方法所掩盖的DNA串联体的结构信息。

另外，该检测方法在均一溶液中进行，最大程度避免了由于孵化、探针标记、无限稀释、电场强度等对DNA串联体结。