动物病毒灭活验证报告.doc

病毒灭活验证报告文件编号:编制:审核:批iff:H期:1、 目的：确认病毒灭活参数的有效性2、 范围：——原料3、 验证依据：《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原贝U》4、 验证项目：在工艺过程中病毒滴定验证结果：病毒检验5、 验证结论：病毒灭活参数有效1. 目的：所有用于医疗器械生产的生物性原材料等都有受到病毒污染的可能性，为验证 “——”的生物原材料.一种猪细小病毒、伪狂犬病毒病毒的感染情况，特进行 下述实验验证确保生物原材料的安全性验证依据：《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》2. 范围:适用于本公司 产品3 .职责：3.1技术部负责对病毒灭活验证的组织与实施3. 2检测中心负责产品的验收及计量、检验器具的检定3. 3生产部负责协助验证工作的实施3. 4质量部负责验证档案的存档3. 5验证小组成员：3. 5. 1人员姓名部门职责管理者代表批准方案、批准报告；技术部长负责制定验证方案和形成报告；生产部长负责试验样品的准备；质量部长负责计量器具的确认；负责对产品性能进行评价， 并提供检测报告；3. 5. 2时间安排2014年9月10日开始4 .程序：4.1 生物原材料.■…的病毒污染验证文献综述根据现有的研究结果，猪的病毒包括猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪瘟、圆环病毒、 口蹄疫、水泡、乙脑等病毒，其中猪细小病毒、伪狂犬病毒可感染人类。

以下按 猪源性病毒的来源、种类及分布；理化特性；检测方法的次序对各病分述如下： 附表1 猪源性病毒的特征病毒名称 病毒的分类核酸类型囊膜病毒颗粒大小（nm）猪细小病毒 B19DNA20伪狂犬病毒 HBVDNA45伪狂犬病毒 在37C下的半 衰期为7h, 8C 可存活46天， 而在25 C干 草、树枝、食 物上可存活 10〜30天病毒在pH49之〕nJ保持稳定5 %石炭酸经2min灭活，但0.5 % 石炭酸处理32天后仍具有感染 性对乙酰、氯仿等脂溶剂以及 福尔马林和紫外线照射敏感附表2 猪源性病毒的理化性质病毒名称 温度耐受性化学物质敏感性猪细小病毒 可耐70C能抵抗脂溶剂、酸、甲醛蒸汽和 紫外线，对漂白粉或氢氧化钠敏 感，具有良好的血凝活性附表3猪源性病毒的检测方法病毒名称血清抗体检测方法病毒抗原检测组织样品方法猪细小病毒血凝抑制新鲜脏器间接免疫荧光技术伪狂犬病毒中和试验患病动物的病料如脑直接免疫荧光技术或扁桃体的压片或冰冻切片参考文献1、 《猪细小病毒病及其防制》一丁壮畜禽流行病防治丛书金盾出版社2、 冼琼珍;黄良宗;彭启明;王淑敏;顾万军;潴伪狂犬病毒和猪细小病毒二联PCR 诊断方法的建立[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第 十次学术研讨会论文集（上）[C];2003年3、 周泰冲;;猪伪狂犬病毒对人的感染性问题（综述）[J];兽医药品通讯;1986年03 期4.2试验材料试验指示病毒为水疱性口炎病毒、伪狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒和猪细小病毒。

培养病毒用细胞株为Ver和p k - 15细胞（由中国药品生物制品检定所引 入），培养液为含10%胎牛血清的M E M o实验用胶原贴敷料样品共3批 次，为有效期内产品；抗荧光抗体购自中国兽医药品监察所o4.3试验方法：4. 3.1细胞毒性测定，用2 m o 1 / L氢氧化钠溶液把酸性液态胶原p H调至 中性，将pH3. 0的酸性溶液和中性溶液进行倍比稀释后加入到细胞中，用 M T T染色法测定其对细胞的毒性作用4. 3.2酸性酶解溶液灭活病毒工艺 取定量的酸性液态胶原，按9： 1的 比例分别加入P R V、V S V、P V 1和P P V指示病毒，混匀后立 即取部分样品用2m o 1 / L氢氧化钠溶液进行中和，根据细胞毒性测 定结果选择样品稀释度作为病毒灭活的起始病毒滴度其余样品分别于0・5、2、6、24、48、72h取样测病毒残留滴度，计算病毒灭活对数值（LgT C I D 50 / m 1 ） o4.3.3 60C o - Y射线辐照灭活病毒工艺 取定量的液态胶原蛋白，按9:1的比例分别加入PRV、V S V . P V P P V指示病毒，混匀后先取 出部分样品作为液体对照，并测定起始病毒滴度。

剩余样品分装成5ml/瓶 进行冷冻干燥，取出2瓶冻干品作为对照将冷冻干燥的瓶装胶原蛋白经 10-15 k G y剂量 的电子束射线辐照灭活病毒处理（绍兴华能电子加速器有限 公司）辐照后的样品溶解后测病毒残留滴度，对照样品则根据细胞毒性测定 结果选择样品稀释度作为病毒灭活的起始病毒滴度，计算病毒灭活对数值o4. 3.4 存活病毒滴度测定 采用微量细胞病变法试验样品经1 0倍系列稀释后加入已接种细胞的96孔培养板中，每个稀释度做8孔重复将培养 板置37 C二氧化碳孵箱内培养72 h （接利| PP V的P K-15培养1 20 h ）, 在光镜下观察细胞病变效应（CPE）,根据K a r b e r氏法计 算病毒滴度4. 3.5免疫荧光染色法检测P P V 将P P V接种于P K- 15细胞中，培 养120 h后，用抗P P V荧光抗体对细胞进行直接免疫荧光抗体试验，按照抗体说明书要求进行操作4. 3.6 细胞盲传 病毒灭活后的样品均以高浓度加入细胞中做细胞盲传3 代培养，观察是否出现细胞病变在细胞盲传3代的全过程中，任何时段 出现细胞病变均视为阳性（+ ）,说明病毒未被完全灭活；未出现细胞病变视 为阴性（-），说明样品中病毒已被完全灭活。

4、 4效果的判定判断病毒去除/灭活的有效性须综合考虑，不能仅以病毒去除/灭活的量来确 定在确定有效之前，必须考虑如下因素，审慎评价每次验证结果4.4.1. 验证试验所选择的病毒是否适宜，病毒验证的设计是否合理4.4.2. 病毒降低量（loglO） >4 logs,表示该步骤去除/灭活病毒有效如因检测 方法造成病毒降低量V4 logs时，应盲传三代，如无病毒检出，可认定是有效的灭活病毒 方法4.4.3. 病毒灭活动力学可更好的显示病毒灭活的效果病毒灭活通常不是简单 的一级反应往往是起始反应速率快，其后变慢如果病毒灭活速率随时间明显 降低，表示该方法可能无效，或者残留的指示病毒对该灭活方法有抵抗力，说明 该步病毒灭活方法无效4.4.4. 病毒实际滴度为基础病毒，指示病毒与样品1:9的比例混匀后零点取样的 病毒滴度，通过与经去除/灭活病毒后的测定的实际病毒残留量的比较，作为该 病毒去除/灭活方法（步骤）实际的灭活病毒的量5. 验证要求5.1达到病毒灭活的有效性5. 2得出病毒灭活速率和灭活曲线5. 3确定预定去除/灭活病毒效果的参数及允许变化的幅度5.4确定指示病毒滴度5. 5加入的病毒与待验证样品体积比不高于1 ： 9o5.6验证过程中每步取出的样品直接进行病毒滴定。

6. 工艺参数的确定6. 1对确定的参数进行试模6.2确认的工艺参数及相关文件由技术部汇总存档7. 记录7. 1记录归档质量管理部病毒灭活验证最终报告1、 目的：所有用于医疗器械生产的生物性原材料等都有受到病毒污染的可能性，为验证”的生物原材料-—・种猪细小病毒、伪狂犬病毒病毒的感染情况，特进行 下述实验验证确保生物原材料的安全性验证依据：《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》2、 范围：适用于本公司 产品3、 试验结果如下：3.1酸性酶解溶液工艺灭活效果接种在胶原蛋白中病毒经酸性酶解溶液处理2h以上，连续3次重复试验结果表明，对VS V、PRV、PVT和PPV的 灭活对数值分别为5.54. 5. 7 1、6.30和5 . 13 （表1 ）处理后的样品经 细胞盲传3代培养，均未出现细胞病变结果显示，酸性酶解溶液对胶原蛋 白中的病毒具有良好的灭活效果表1酸性菌解溶液对胶原蛋白中的病毒灭活效果（』3）组别处理时间（h）"%VSVPRV PVTiPPV对照组05. 040,195. 2i ft 145. 80 Q 144. 63O 13处理组0. 5Q 170.19<-Q50. 34Q 260. 55ft 142< 一0. 5《一。

5＜一5<-0.54< 一0. 5< 一 0. 5<-Q5<-0.56《一 0. 5C 一 0. 5<-Q5<-0.524《一 0. 5《一 0. 5<-ft 5<-0.548《一 0. 5《一 0.5<-0.5<-0.572《一 0. 5<一0.5<-0.5<-0.5细胞对照（一）(-)(-)(-)盲传3代72(-)(-)(-)(-)注:-0.5 L瓯』蝴该试验方法检测的极限值;（一）为未见细胞病变3.2 6 0Co- Y射线灭活效果经照射剂量为12.3 kGy的60C o - Y射线辐 照灭活工艺处理结果表明，接利|在胶原蛋白海绵中的VS V、P RV、PVI和PPV指示病毒灭活对数值分别为6.00、5.75、6.00和5.0 0 （表2）灭活后的样品经细胞盲传3代均未见细胞病变出现初"加7翳鼬嘛原翻泌神福颇液果酬t（姒）1H7L•AJVSVPRV用PW魅螂白05.50+0.255.25+(1135.50+0.134.50+0.13IW螂白25<-Q5《-0,555《-0.5m(-)(-)(-)(-)割打代25(-)(-)（一）（一）也号为未贴瞬t4、验证结果分析与评价在样品中病毒滴度与理论值相符合。

经模拟工艺处理后，未检测出指示 病毒，证明本工艺可以灭活病毒病毒灭活判定为有效部门姓名分析、评价日期最终批准批准人： 日期：。