小鼠脂肪细胞糖尿病药物筛选模型的简历及应用.pdf

小鼠脂肪细胞糖尿病药物筛选模型的优化及应用小鼠脂肪细胞糖尿病药物筛选模型的优化及应用 栾卫卫1，邓玉林1,2∗，董润安1，庆宏1，李良1,2，李伟1,2，戴荣继1,2，禹玉洪1,2 1 北京理工大学生命科学与技术学院，北京， （100081） 2 北京理工亘元医药技术开发中心有限公司，北京 （100081） 摘摘 要要：糖尿病已经成为世界范围内危害人类健康的主要疾病之一，对糖尿病的研究和治疗 具有重要意义，本文首先建立并优化小鼠脂肪细胞糖尿病药物筛选模型，然后使用临 床抗糖尿病药物对该模型进行考察，并对海糖平（H）和杉糖平（S）两种降糖新药 进行了筛选通过 Western－blot 法检测 GLUT4（葡萄糖转运蛋白 4）以确定药物的 药效 结果表明， 用临床抗糖尿病药物考察模型能客观反映该药物药效 在此模型上， 对杉糖平和海糖平的各个馏分进行初步筛选，发现了两种药物的一些有效成分 关键词关键词：2 型糖尿病，GLUT4，Western blot，药物筛选 1．． 引言引言 糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病, 以慢性血糖代谢紊乱为主要特征胰岛素绝对或 相对不足, 引起糖、脂肪、蛋白质和继发性维生素、水、电解质代谢紊乱, 常并发动脉粥样硬 化、微血管病变、神经系统病变, 从而导致多个系统、多个脏器的损害[1]。

如何控制治疗糖尿 病及其并发症是当前世界医学领域重要课题，研制开发有效的治疗糖尿病药物成为生物制药 的重要目标 近年来，葡萄糖的体内运转成为研究热点，特别是葡萄糖转运蛋白GLUT4[2]GLUT4 主 要分布于脂肪、骨骼肌和心肌组织细胞内，是人和啮齿动物主要的葡萄糖转运体[3]GLUT4 含量减少或者活性降低，有可能诱发 2 型糖尿病因此，通过测定药物诱导细胞膜上GLUT4 量的多少，判断药物是否有促进GLUT4 转位作用，初步确定它是否有降糖作用[4-6]本文建 立了一种Western blot法，对GLUT4 进行定性和定量检测，确定药物的药效 2．． 实验部分实验部分 2.1 药品药品 胶原酶Ⅷ(Sigma Chemical Co.)，牛血清第五组分（Sigma Chemical Co.）,羊抗兔－HRP, 甲胺（北京经科宏达生物科技公司） ，兔抗 GLUT4（北京赛泰克生物科技公司） ，其它药品均 属分析级 2.2 脂肪细胞的制备脂肪细胞的制备 脂肪细胞取自昆明小鼠（30g±）的附睾脂肪垫分离方法参照Rodbell[7]，Gliemann[8]和 Marshall[9]方法加以修改。

小鼠脂肪垫在无菌条件下取出，剪碎置于消化液中，37℃水浴消化 1h，不时振荡，消化液为KRBH buffer，包括 25mM的Hepes，200nM腺苷，1％牛血清白蛋白 和 1.5mg/mL胶原酶消化完毕后用 75 目筛网对组织消化液进行过滤，离心两次（1200×g， 1min） ，取上层脂肪细胞的悬液 2.3 药物与细胞的预温育药物与细胞的预温育 将药物加到细胞悬液中，37℃水浴温育 40min 2.4 细胞膜的制备细胞膜的制备 ∗通讯联系人：邓玉林 ：010－68914607，E－mail：deng@ -1- 脂肪细胞的质膜按文献方法制备[10-12]，离心管中的细胞悬液在 4℃下超声破碎，离心 （3000×g,15min, 4℃） 弃去表面悬浮的白色脂肪层， 悬液继续离心 （12000×g， 25min， 4℃） ， 沉淀用MediumⅠ(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，250mM蔗糖，pH7.4) 稀释成溶液作为待测 的膜样品溶液 2.5 GLUT4 含量测定含量测定 GLUT4 的含量采用Western blot的方法测定，其具体操作如下[13-15]： （1）电泳：采用分离胶浓度为 10％，浓缩胶 5％进行蛋白分离富集。

浓缩胶 80V 电压，分 离胶 120V 电压，冰浴中电泳大约 1.5h，进行转膜 （2）转膜：将滤纸、海绵、胶、膜、海绵、滤纸等三眀治夹层安装好，正负极放到电转移装 置，倒入电转移缓冲液，进行电转移15V, 30mA，冰浴下电转移 4h然后用丽春红检验蛋 白是否转移到膜上 （3）封闭：将膜放入 5％的脱脂奶粉中，4℃，封闭一夜 （4）与一抗的反应：将封闭好的膜加入一抗，37℃温育 2h （5）与二抗的反应：用 TBS 缓冲液对用一抗温育过的膜进行漂洗，漂洗三次，每次 10 分钟， 然后加入二抗 37℃温育 1h （6）底物显色：TBS 漂洗二抗温育过的膜，漂洗三次，每次 10 分钟，然后加入底物进行显 色，定量，拍照保存 2.6 总蛋白浓度的测定总蛋白浓度的测定 在制备好细胞膜悬液后，膜上总蛋白浓度用考马斯亮蓝法测定，方法见Timothy[16]所述 2.7 数据分析数据分析 所有数据均用±S 表示，并用 SPSS 和 Excel 统计软件进行数据整理和统计，多组间显著 性差异由 t 检验比较，P＜0.05, 认为具有显著性差异 3．． 实验结果实验结果 3.1 胰岛素（胰岛素（In）的促进作用）的促进作用 GLUT4 对胰岛素十分敏感，在很短的时间内，胰岛素使细胞内 GLUT4 大量转移到细胞 膜上，胰岛素对 GLUT4 转位的调节是脂肪细胞和肌肉细胞中最重要的调节方式，转位后的 GLUT4 对葡萄糖的吸收和对维持体内正常的血糖平衡有着决定性的作用。

图 1. 胰岛素对 GLUT4 转位的影响 P<0.05，**P<0.01 有显著性差异 -2- 图 1 可以看出，在 1-100nM 内，细胞膜上的 GLUT4 含量随胰岛素浓度的增加而增加 在 100nM 时，与对照相比，GLUT4 转位增加近 6 倍当胰岛素浓度超过 100nM 时，细胞膜 上的 GLUT4 的含量基本没有变化当胰岛素浓度达到 100nM 时，本实验条件下的脂肪细胞 GLUT4 达到饱和，胰岛素的浓度增加也不会增加细胞膜上 GLUT4 的含量 3.2 磺脲咯咧吡嗪（磺脲咯咧吡嗪（GP）对）对 GLUT4 转位的影响转位的影响 咯咧吡嗪是第二代磺酰脲类的抗糖尿病药物，对大多数 2 型糖尿病患者有效具体的作用 机理也比较复杂，主要作用为刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，当然先决条件是胰岛β细胞还有 一定的合成与分泌胰岛素的功能此外还有胰外效应，包括改善外周组织（如肝脏、肌肉、 脂肪）的胰岛素抵抗状态本文主要采用不同浓度的药物浓度与细胞共培养，来观察此类药 物对 GLUT4 转位作用的影响，具体操作是细胞与药物在 37ºC 下共培养 40min，最后破碎取 膜蛋白进行免疫测定。

图 2. 咯咧吡嗪对 GLUT4 的影响 P<0.05，**P<0.01 有显著性差异，GP：咯咧吡嗪，In： 胰岛素 图 2 显示，在 1nM 时促转位作用不明显，在 10nM 时，作用明显，是对照组的 1.8 倍， 在 100nM 时效果反而降低， 这可能是由于药物对细胞产生毒性作用的结果， 100nM 的此药合 100nM 的胰岛素一起，作用更强，提高到了对照组的 2 倍 3.3 甲胺（甲胺（M）对）对 GLUT4 转位的影响转位的影响 SSAO 酶能够催化其内在底物（甲胺）脱去氨基，生成具有毒性的甲醛以及过氧化氢和氨水此高反应性的醛可以引起蛋白质的交联，使蛋白质的高级糖基化过程恶化，引起内皮损害 -3- 图 3. 甲胺对 GLUT4 转位的影响 P<0.05，**P<0.01 有显著性差异，In：胰岛素，M：甲胺 图 3 表明，甲胺对 GLUT4 的转位有抑制作用，而且剂量越大抑制作用越强，加药 10nM 后下降为对照组的 0.6；加入 100nM 下降为对照组的 0.57；在甲胺 100nM 时，加入 100nM 胰 岛素时，GLUT4 的量稍有增加，但增加不是很明显，这可能与胰岛素加量有关。

3.4 杉糖平（杉糖平（S）的筛选结果）的筛选结果 香榧 Torreya grandis Fort 是红豆杉科榧属植物，其干燥成熟种子（榧子）为传统中药，具 有悠久的历史，始载于《神农本草经》 近年来，由于从红豆杉科植物中发现了具有强大抗癌 活性的天然产物紫杉醇，国内外学者对该科各属植物的化学成分及生物学活性进行了大量的 研究，榧属植物对于人类心血管系统和内分泌系统的调节与保护作用以及其抗肿瘤活性等逐 渐为人们所认识和了解现对其有效成分的筛选结果如下： （1）杉糖平 1（S1）的降糖效果 实验中对单体化合物 S1 不同浓度 （0.01－2g/L） 的作用效果进行了测试， 用加药后 GLUT4 的相对含量的变化情况来判断药效，同时以此跨度的浓度来确定 S1 发挥降糖作用的有效浓 度 图 4 S1 的降糖效果 P<0.05，**P<0.01 有显著性差异 -4- 图 4 显示， S1 在 0.01－2g/L 都有明显的促 GLUT4 转位作用， 在 0.1g/L 时， 效果很明显； 药剂量增加，GLUT4 的含量反而相对降低，可能是剂量太多而产生细胞毒作用从结果可以 看出，S1 具有促转位的作用，可以认为其具有降糖效果。

(2) 杉糖平 4（S4）对 GLUT4 转位的影响 图 5. 杉糖平 4（ S4）对 GLUT4 转位的影响 P<0.05，**P<0.01 有显著性差异 S4 的浓度测试范围是 0.1－20g/L，从图 5 可以看出 S4 在测试的 1－10g/L 的范围内，随着药量的增加，降糖效果明显增加，其中在 10g/L 时 GLUT4 的量是对照的 3 倍，10g/L 时则更高是对照的 4 倍，药量过多效果下降，这是产生细胞毒的原因实验结果说明 S4 是有效成分 (3)杉糖平 5（S5）的降糖效果 下图是杉糖平 5 的测试结果 图 6 杉糖平 5（S5）对 GLUT4 的转位影响 * P<0.05，**P<0.01 具有显著性差异 图 6 实验结果显示， 在 0.01—2g/L 这个测试范围内， S5 没有明显的促 GLUT4 转位作用，-5- 反而使 GLUT4 的相对含量降低，0.01g/L 时 GLUT4 降为对照组的 50%；1g 虽有上升但是仅为对照组的 61%；2g/L 时则更少；为对照组的 20％；总的看来 S5 不是有效成分 3.5 海糖平（海糖平（H）有效成分的筛选）有效成分的筛选 海糖平系从鸢尾科植物蝴蝶花(Iris Japonica Thunb)的叶中提取而得。

该植物取自于中国海南，当地民间用其叶子的水煎液为偏方用来治疗糖尿病，具有良好的效果，但是其中何种成分发挥降糖作用以及作用机制如何目前尚不清楚， 以蝴蝶花作为治疗糖尿病的药物进行研究也未见报道对其有效成分的筛选结果如下： (1)海糖平 6（H6）的降糖效果 图 7. 海糖平 6（H6）对 GLUT4 转位的影响 * P<0.05，**P<0.01 有显著性差异 海糖平 6（H6）的浓度测试范围是 0.01－2g/L，结果显示 H6 有明显的促 GLUT4 转位作用， 0.01g/L 时结果是对照组的 3 倍，而药量增加，GLUT4 的量并没有增加，但是却都是对照组的 3 倍，说明 H6 在 0.01g/L 时 GLUT4 已经全部转位，即使再加药也没有更多的 GLUT4转位可以断定 H6 是有效成分 (2) 海糖平 7（H7）的降糖效果 单体化合物H7 度测试范围也是0.01－2g/L ， 实验结果表明 H7 有促GLUT4 转位的作用， 0.01g/L 时 GLUT4 的量是对照组的 1.2 倍，0.1g/L 时是对。