实验十一DNA凝胶回收.ppt

实验十一实验十一 DNA DNA凝胶回收凝胶回收 一、实验原理一、实验原理 通过一定的方法将琼脂糖凝胶上需要的目的DNA带回收下来，用于下游实验 琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法 1.柱回收试剂盒 是目前最简单快速的回收方法，只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer彻底溶解，上包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后继实验这个方法几乎不需要什么技巧就能得到稳定的结果，也是目前最多商品化试剂盒选择的方法但是这个方法不适合用于大片断的回收2.低熔点琼脂糖 传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65度保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀这个方法现在用的人已经不多了 以前经费紧张，低熔点琼脂糖贵，比较经济方法就是常规琼脂糖电泳后，在目的条带前方挖槽，灌入低熔点琼脂糖，凝胶后再电泳一小会儿，等条带进入低熔点琼脂糖区域再切出来，这样就非常节约了 二、实验目的二、实验目的 1. 从含有从含有目的基因片段凝胶块上回收目的基因片段凝胶块上回收DNADNA。

2.2.回收目的基因片段为下步连接反应回收目的基因片段为下步连接反应作准备作准备仪器及耗材：天平、台式离心机、微量移液器及吸头、EP管材 料： 含有目的基因酶切产物的凝胶块试 剂： AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 ；无水乙醇；三、实验仪器、材料和试剂三、实验仪器、材料和试剂四、实验步骤四、实验步骤1.在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎计算凝胶重量（提前记录 1.5 ml 离心管重量） ，该重量作为一个凝胶体积（如 100 mg=100 μl 体积） 2. 加入 3倍凝胶体积的 Buffer DE-A，混合均匀后于 75°C加热（低熔点琼脂糖凝胶于 40°C加热） ，间断混合（每 2-3 min） ，直至凝胶块完全熔化（约 6-8 min） * Buffer DE-A为红色溶液在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化 3. 加 0.5倍Buffer DE-A 体积的 Buffer DE-B，混合均匀当分离的 DNA 片段小于 400bp 时，需再加入 1个凝胶体积的异丙醇 加Buffer DE-B后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。

4. 吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2 ml（试剂盒内提供）离心管）中，12,000×g离心 1 min 5. 将制备管置回2 ml离心管，加500 μl Buffer W1，12,000×g 离心30 s，弃滤液6. 将制备管置回2 ml离心管，加700 μl Buffer W2，12,000×g离心30 s，弃滤液以同样的方法再用 700 μl Buffer W2洗涤一次 12,000×g离心1 min 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响7. 将制备管置回 2 ml离心管中，12,000×g离心 1 min 8. 将制备管置于洁净的 1.5 ml 离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加 25-30 μl Eluent 或去离子水，室温静置 1 min12,000×g离心 1 min 洗脱 DNA 将Eluent或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。