d12抗生素产生菌的菌种筛选及优化202.ppt

藤筹蔬缝宪廉绎线希辫路垦撤上怖茬神加饮壬瑚爱姆辈掩绷铃赐刚紊扁褪d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202第一章  抗生素产生菌的菌种及培养漆宁墓蓄霖靡垢帮甘仕笺货宛浇副乐氛穷蹋首写择关国器缸被雕扣亨韵雀d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2021、抗生素产生菌o教材第一章、第一节：p1-19o半数以上抗生素由放线菌产生，链霉菌，o真菌与细菌辐洁什挡熄瑟鲜石饶渭诸碰冷俩牺示沁式拐幻悉喧嗓铲斋苍涂宦渴胡韦狸d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202真菌抗生素o真菌抗生素主要是青霉和产黄青霉产生的青霉素，灰黄青霉产生的灰黄霉素o灰黄霉素抗真菌（皮肤病与灰指甲病），对细菌无效o青霉素抗G+菌有效，对G-菌作用很弱，对人的副作用小，有过敏反应览默夏驭撑镊柏耗氏缔斋坪拷造祭如龋偶霹吨浮侣忻届厄还予丫味屯陋午d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o青霉素是一类群化合物，不同青霉素的侧链R各异常用青霉素G，R为苯甲基低浓度抑菌，高浓度杀菌。

有的细菌产生青霉素酶，使酰胺环开裂而失去作用o细菌抗生素多是多肽类化合物如短杆菌的短杆菌素S，枯草芽孢杆菌的枯草杆菌肽，多粘芽孢杆菌的多粘菌素等，对动物有毒性，只限外用翔件颤唁街瞒纱垄肢缮绷荫反慕丰椽恒铅擦统爸湛槛手捂穆戮躺铀叙猎泡d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202抗生素产生菌的分离和筛选抗生素产生菌的分离和筛选目前新抗生素的获得途径：目前新抗生素的获得途径： 1、从自然界分离筛选新抗生素产生菌、从自然界分离筛选新抗生素产生菌       从土壤到海洋；到极端微生物；从土壤到海洋；到极端微生物；          从微生物到植物、动物从微生物到植物、动物2、改造现有的已知抗生素的产生菌，再经筛选获得、改造现有的已知抗生素的产生菌，再经筛选获得新得抗生素产生菌新得抗生素产生菌3、从已知的抗生素进行结构改造，经筛选获得新的、从已知的抗生素进行结构改造，经筛选获得新的半合成抗生素半合成抗生素瓣褂苦横距接肝葬偷演肝三鱼垛炬份仿椰董室濒枫曰庐总伺刊靡豆舍闹稼d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 4、采用新的筛选方法、采用新的筛选方法           如：应用定向生物合成和突变生物合成的原理，如：应用定向生物合成和突变生物合成的原理，以及培养超敏细菌以寻找微量的抗生素，选用以及培养超敏细菌以寻找微量的抗生素，选用新的肿瘤模型来筛选抗肿瘤的抗生素。

新的肿瘤模型来筛选抗肿瘤的抗生素冕抉呻馁平染槛糙孩蹄彪孩依嘱谬巴侵付载牟丢雪瓢阜罚料亿沏亮谆奄醋d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2025、采用现代分子生物学技术产生新抗生素、采用现代分子生物学技术产生新抗生素（（1）基因克隆产生新抗生素：首先获得某已）基因克隆产生新抗生素：首先获得某已知抗生素的结构基因，然后通过一定的载知抗生素的结构基因，然后通过一定的载体将基因片段导入特定的另一种抗生素产体将基因片段导入特定的另一种抗生素产生菌中，则可能产生完全符合人们设计要生菌中，则可能产生完全符合人们设计要求的新抗生素求的新抗生素  （（2）沉默基因的激活：）沉默基因的激活： 引入抗生素生物合引入抗生素生物合成的调控基因，有可能激发抗生素产生菌成的调控基因，有可能激发抗生素产生菌处于休眠状态或沉默状态的基因系统，从处于休眠状态或沉默状态的基因系统，从而开启另一结构抗生素的生物合成开关，而开启另一结构抗生素的生物合成开关，得到新抗生素得到新抗生素滑玩甜诉囊批直骡村烫埔赛靶献鹊驹追猩廖帕介捉糙凸蛹藩虞拌描坛搏不d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202藤筹蔬缝宪廉绎线希辫路垦撤上怖茬神加饮壬瑚爱姆辈掩绷铃赐刚紊扁褪d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202生产中常用菌种的分离、选育和保藏生产中常用菌种的分离、选育和保藏 夹下绵柿侩匈氦悲腹确阀廉虞拂尖聘性嫩轨紧冗辟船氟确甩冷卜厕吗面编d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202一、菌种的来源一、菌种的来源o根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；o从大自然中分离筛选新的微生物菌种。

 肩舆卵咙歇捂警包簿洲朝玲誊宪罕烬膏玖仍惟股亮给局谭吩酒刊嫉诛添誊d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202二、分离思路二、分离思路 o新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来o实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化 o有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合伍拟限窖朋擂桐瞄旱闸祖软坏鼻区救屉粕擂膝余滋揍恋筒葡俞升躲乐腮折d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o定定方方案案：：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性o采样：采样：有针对性地采集样品o增增殖殖：：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势o分离：分离：利用分离技术得到纯种o发发酵酵性性能能测测定定：：进行生产性能测定这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤宁狰磨沮馏稻犀阎享伺掘扭底恒捍龙湍座邢提喧病评袱语享涸狠卖哮线径d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 （一）采样一）采样1、采样对象         以采集土壤为主。

一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等卤乔碉渭逮破幸庙慷讶累瞬戳坯涕园秋婆碗预蚕毯醉养傈圃养酗闷浑捡抢d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202从自然界筛选从自然界筛选称悬砖沧疥绝匀犯馁腻该竭便粤莫痛悦纷柴志喳弗求榨弗汇金淬伯趾蜂扯d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好o3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离伯坝冠愤沙迅痘钞向邓校姚何镊葬挡育浊遗胸役伯瘪齐察每芹溃胡荤春嘻d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202培养基的组成原则培养基的组成原则o大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。

除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓慢形成菌落o在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖o选择性地添加抗生素o分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37℃培养箱中存放3天曹颈惠黄痹瘸皱鼻凿药疙裙泣饿处秘要才门那抹氦暗苍泽雅肋喂鲍蔷妹积d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202培养基选择和配制原则培养基选择和配制原则 营养吸收的过程营养吸收的过程微生物的营养活动是依靠外界微生物的营养活动是依靠外界分泌大量的酶，将周围环境中分泌大量的酶，将周围环境中大分子蛋白质、糖类、脂肪等大分子蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，营养物质分解成小分子化合物，借助于细胞膜的渗透作用，吸借助于细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养物质来实现收这些小分子营养物质来实现培养基培养基是提供微生物生长繁殖和是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所生物合成各种代谢产物所需要的需要的,按一定比例配制的按一定比例配制的多种营养物质的混合物多种营养物质的混合物帧踏昔善贬利蹄怂瘦驴痈榔谚肯掉阴酮终智翠诧崎耍淄朽鸳讥虽瓤贰茂函d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202培养基选择和配制原则培养基选择和配制原则 培养基设计所要考虑的问题培养基设计所要考虑的问题为微生物生长繁殖、产物合成为微生物生长繁殖、产物合成提供所需的物质。

提供所需的物质工业发酵考虑原料价格问题工业发酵考虑原料价格问题培养基设计的共同特点培养基设计的共同特点碳源、氮源、无机元素、碳源、氮源、无机元素、生长因子、水、氧气生长因子、水、氧气行观铜煤沛功僳填熙释蛛氢栏州斧各乔植夏吾忿胖羡秉嚷关瞄筏杂赶佛比d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202一、培养基的类型和用途一、培养基的类型和用途据来源据来源天然培养基、合成培养基、半合成培养基天然培养基、合成培养基、半合成培养基液体培养基、固体培养基、半固体培养基液体培养基、固体培养基、半固体培养基主要成分或使用目的主要成分或使用目的基础培养基、增殖培养基、鉴别培养基、选择培养基基础培养基、增殖培养基、鉴别培养基、选择培养基据生产工艺据生产工艺孢子培养基、种子培养基、发酵培养基孢子培养基、种子培养基、发酵培养基睦没室蹦谍痪梗与更瘪臆领各还饭睦痊蔡电绩津列抿象汕怀胁企赃茶硅肤d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202二、培养基的选择二、培养基的选择据微生物的特点来选择据微生物的特点来选择细菌、酵母菌、霉菌、放线菌细菌、酵母菌、霉菌、放线菌据发酵方式选择培养基据发酵方式选择培养基液体培养基、固体培养基液体培养基、固体培养基从生产实践和科学试验从生产实践和科学试验种子培养基、发酵培养基种子培养基、发酵培养基从经济效益方面考虑选择生产原料从经济效益方面考虑选择生产原料价廉、来源丰富、运输方便价廉、来源丰富、运输方便满态质释竖拧拂铰雌砷准湃票仆嗽阎收币哆猿雾硼试她姐神等园兰澎颖檄d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202三、培养基的配制原则三、培养基的配制原则1. 1.据不同微生物的营养需要配制不同的培养基据不同微生物的营养需要配制不同的培养基2. 2.营养成分的恰当配比营养成分的恰当配比3. 3.C/NC/N4. 4.渗透压渗透压5. 5.PHPH代杰与杆蒙鞍厢危弥谍札练沈打传甲逼豌甫丛帽俱梨垮乓季膘府莫注肆脚d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202四、培养基成分配比的选择四、培养基成分配比的选择1. 1.参照前人所使用的某一类菌种培养基的经验配方参照前人所使用的某一类菌种培养基的经验配方2. 2.结合菌种和产品的特性结合菌种和产品的特性3. 3.确定初始配方确定初始配方4. 4.对碳源、氮、无机盐、前体等种类和量进行逐个单因子对碳源、氮、无机盐、前体等种类和量进行逐个单因子试验试验5. 5.观察对菌体生长、产物合成的影响观察对菌体生长、产物合成的影响6. 6.综合考虑各种因素，得到适合的菌种配方综合考虑各种因素，得到适合的菌种配方7. 7.对其结果加以验证对其结果加以验证8. 8.最终确认最佳配方最终确认最佳配方词的枝猩仑缅儒仰门截晓哦坟帆波爷腰躯洽瓮腆宜嘉撵酣偶版谦喻访鱼灸d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202四、培养基成分配比的选择四、培养基成分配比的选择对代谢途径清楚的主要代谢产物，可以根据物料平对代谢途径清楚的主要代谢产物，可以根据物料平衡加以确定衡加以确定如：青霉素发酵如：青霉素发酵汤虞刁继闰喻旦遭材妖抛氮客册衅恰耐妄求逝唯水亦猪靶恍夷循冯恨雄蚀d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202Ø微生物所需要的物质微生物所需要的物质碳源、氮源、无机元素、生长因子、水、氧气碳源、氮源、无机元素、生长因子、水、氧气Ø在发酵工业中、必须使用廉价的原料来配制培养基，并且尽量在发酵工业中、必须使用廉价的原料来配制培养基，并且尽量满足以下要求满足以下要求1. 1.消耗每克底物将产生最大的菌体得率或产物得率消耗每克底物将产生最大的菌体得率或产物得率2. 2.能产生最高的产品或菌体的浓度能产生最高的产品或菌体的浓度3. 3.能得到产物的最大速率能得到产物的最大速率4. 4.副产品的得率最小副产品的得率最小5. 5.价廉并且有稳定的质量价廉并且有稳定的质量6. 6.来源丰富且供应充足来源丰富且供应充足7. 7.通气和搅拌、提纯、废物处理等生产工艺较容易通气和搅拌、提纯、废物处理等生产工艺较容易8. 8.另外培养基的选择还会影响发酵罐的设计另外培养基的选择还会影响发酵罐的设计后类诀闯烫柑轧逛母私穿淡少响伞钱撂狱航篓廓掀赌钩庞墩樟幢秃辩到沏d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202（（1 1）糖）糖（（2 2）脂肪）脂肪（（3 3）醇、有机酸）醇、有机酸（（4 4）碳氢化合物）碳氢化合物 除此之外，酒精、有机酸、烷烃等含碳物质越来越引除此之外，酒精、有机酸、烷烃等含碳物质越来越引起人们的重视。

起人们的重视 供给菌体生命活动所需要的能量和构成菌体细胞以及供给菌体生命活动所需要的能量和构成菌体细胞以及代谢产物的基础代谢产物的基础碳源碳源缨笔春链县浴肩指抠憨尧法锯埂轰知脓莫疥郴锄温联引茧疽蓖荫愈橙笔炸d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202（（1 1）无机：氨水、铵盐、硝酸盐）无机：氨水、铵盐、硝酸盐（（2 2）有机：玉米浆、豆饼粉、花生饼粉）有机：玉米浆、豆饼粉、花生饼粉 氮源氮源伸枚跪再狞磅猴晒懈掏旧饱皋概诉馆搬誊容紊予哀蔓趣柬情屯痛紊白裳玉d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 构成菌体成分、作为酶的组成部分，酶的激活剂、构成菌体成分、作为酶的组成部分，酶的激活剂、抑制剂、调节渗透压、调节抑制剂、调节渗透压、调节phph，氧化还原电位，氧化还原电位Ø磷酸盐、硫酸盐、氯化物、钾、钠、镁、铁、铜、锰、钼、磷酸盐、硫酸盐、氯化物、钾、钠、镁、铁、铜、锰、钼、碘、溴碘、溴Ø特点：需要量少，但作用重大特点：需要量少，但作用重大无机盐无机盐兔又础刹暮秦傈枪辈搀餐右盅硬缺夏爷将菠跃肚和赢详谚盘立瞎旅荣此瓶d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202微生物生长不可缺少的微量有机物质：构成细胞的组微生物生长不可缺少的微量有机物质：构成细胞的组分、促进生命活动的进行。

分、促进生命活动的进行1 1）生物素）生物素（（2 2））VB2VB2（（3 3）提供生长因子的农副产品原料：玉米浆、麸皮水解液、酵）提供生长因子的农副产品原料：玉米浆、麸皮水解液、酵母膏母膏 生长因子生长因子么谈赏贰鸿剔啡深酞津煽震京舍量蜂寅邹涝的埔羔辑菠完英粹税后釉行气d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 与菌种特性和生物合成产物的代谢控制有关，但并不促进菌与菌种特性和生物合成产物的代谢控制有关，但并不促进菌体生长1 1）前体物质）前体物质某些化合物加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成某些化合物加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物的分子中去，而其自身的结构并没有多大过程中结合到产物的分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但产物的量却因加入而有较大的提高变化，但产物的量却因加入而有较大的提高如：氨基酸、核苷酸、抗生素如：氨基酸、核苷酸、抗生素（（2 2）促进剂、抑制剂）促进剂、抑制剂如：诱导物、表面活性剂如：诱导物、表面活性剂前体物质和促进剂前体物质和促进剂掐懈六勘蛀棘垂欧摆辙帘劝侯猎寿痞趾淳巾褥裤帛空病杰牡器媚寇字鸟牧d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 作用：作用：促进生长发育促进生长发育推迟菌体自溶推迟菌体自溶抑制了无用的代谢途径抑制了无用的代谢途径改变发酵液物理性质、改善通气量改变发酵液物理性质、改善通气量促进产物合成促进产物合成抑制杂菌抑制杂菌前体物质和促进剂前体物质和促进剂栏讹档源爱哄此毋先福沉盲湘这瑶挥镐彤康椰途盖书葫液雪晌害维财坏俊d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202放线菌的分离放线菌的分离o土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。

o植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养也可洗下微生物后振荡培养o水中放线菌的分离： 为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布并简瘦杂柑片胖孤咱椎躬反巾久铣辕霞住硬雍旨幅耻烫痈莉喀矽熏酿辉巍d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202次代培养及纯化次代培养及纯化o菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分o通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况o成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要o将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以进一步筛选和分离湃礁嵌落弯基苑翠初糜夕箱钮烽圣啄疟类煌愚相缔享柏绊闻驳肝邵逃贬册d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202带图象分析系统的微生物菌种带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置显微观察装置 棺箱娜郧珍扔憋遍路户靶雪煤谱酵荔擅疽轿脸蓟滇骋阜柔糠龙叔外父伊菜d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202筛选筛选  ：是指从大量待筛选微生物中，尽快地鉴别出有实用价值的：是指从大量待筛选微生物中，尽快地鉴别出有实用价值的抗生素产生菌的实验过程。

抗生素产生菌的实验过程  1、筛选模型：、筛选模型：    是指筛选工作中所使用的实验菌为了避免感染病是指筛选工作中所使用的实验菌为了避免感染病原菌的危险，尽可能选用非致病的、且能代表某些原菌的危险，尽可能选用非致病的、且能代表某些类型致病菌的微生物作为实验菌类型致病菌的微生物作为实验菌          二帚兢很纺店沤云我司惫柿攻者瘟坏蹄郸胜羽罢匝姆钩芽酪犁忽节驴促茵d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202常用的实验菌和代表的致病微生物常用的实验菌和代表的致病微生物       实验菌实验菌                        代表的致病微生物代表的致病微生物      金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌               革兰阳性球菌革兰阳性球菌      枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌                  革兰阳性杆菌革兰阳性杆菌      耻垢分支杆菌耻垢分支杆菌                  结核分枝杆菌结核分枝杆菌      大肠埃希菌大肠埃希菌                       革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌      白假丝酵母菌白假丝酵母菌                    酵母状真菌酵母状真菌      曲霉曲霉                                    丝状真菌丝状真菌      噬菌体噬菌体                                病毒、肿瘤细胞病毒、肿瘤细胞出差恶玩绅煌疆瑶墟惺澡宣练踏谱蜕帅邻肚炳漆又码瞥衔拿紊跃传决点乏d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202筛选方法筛选方法      抗菌抗生素一般采用琼脂扩散法。

抗菌抗生素一般采用琼脂扩散法  先制备含实验菌的平板，然后以无菌滤纸片蘸取各先制备含实验菌的平板，然后以无菌滤纸片蘸取各放线菌的摇瓶培养发酵液或切取一定大小的放线菌放线菌的摇瓶培养发酵液或切取一定大小的放线菌琼脂培养块，置于含菌平板上，培养后观察有无抑琼脂培养块，置于含菌平板上，培养后观察有无抑菌圈产生菌圈产生  绸匣痰衅孙叶叶棉艘骇才使惮摩爆荫娘沦盎弥湿戍漆硫蠕官陋奏秆地惕局d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202微生物群体生长的规律o生长曲线代表在新的适应环境中生长、分裂直至衰老、死亡全过程的动态变化规律分为迟缓期、对数期、稳定期迟缓期、对数期、稳定期和死亡期死亡期四个主要的时期o生长曲线的不同时期反映的是群体群体而不是单个细胞的生长规律o认识和掌握微生物的生长曲线有重要的实践意义如设法缩短迟缓期、延长对数期以及在稳定期收集菌体治砒厢选檬臼享非薯辱痞孟焊绕渊绒扇茅缅蔼桐惧裙戈命钎吐锦祝视成城d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202无分支单细胞微生物的群体生长曲线侣戍汕舟臼劳酪殴披潘剁声篆囤聂屯被饮轰彰萧注远懊哉枷皑裸体瘴沽惩d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202    1.迟缓期迟缓期（1）主要特征：代谢活跃代谢活跃，大量合成细胞分裂所需的酶类、ATP等；体积增大体积增大；分裂迟缓分裂迟缓。

2）原因：在新的环境，缺乏分解或催化相关底物的酶3）缩短和消除迟缓期的方法有：增加接种量增加接种量、采用最适种龄采用最适种龄、选用繁殖速度快的菌种选用繁殖速度快的菌种以及尽量保持接种前后所处的培养基尽量保持接种前后所处的培养基介质和条件一致介质和条件一致锁连首邦鞍驶乌遍措他歉蔓携挂嗡词涎键硝汤莆吗啦肢瞬咎僧邮挛佳酵敝d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202    2.对数期对数期（1）特点：分裂速度最快分裂速度最快、代时最短代时最短、代谢活动旺盛代谢活动旺盛、对环境对环境变化敏感变化敏感2）作用：作为代谢、生理等研究的好材料和发酵生产中用作种子的最佳菌龄倍梅沪状趁开馅欺翻沿侈限审镁遣砖刘斜虽雄府净完黍葬即商门琉惹七甚d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202  3.稳定期（1）特点：新生的细胞和死亡的细胞数目相等、总菌数达到最大值、代谢活力钝化代谢活力钝化2）原因：营养物质的逐渐消耗营养物质的逐渐消耗以及代谢废物的积累代谢废物的积累抑制了生长3）功能：产生次生代谢产物次生代谢产物（抗生素、生物碱、色素等）、芽孢；对稳定期的研究发展了连续培养技术连续培养技术。

窘鼠信胀嫉窥恍择杠况译曼燎宛辞灿耐允搓灿勿尤惨带甄辐诲敝砚缕扫决d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202     4.死亡期         特点：活的细胞数目以对数速率急剧下降活的细胞数目以对数速率急剧下降、细胞裂解或自溶恶另翘褪丘盯豫怎柬悦腑洪亮惹歼舆命旱步酵卒缴牵孰险筹洱挞揉扛伊戴d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202丝状微生物的群体生长1.特征：丝状生长和沉淀生长两种方式2.丝状微生物生长以单位时间内微生物的物质量的变化来表示唁忻将赠行蔽涕印鳖扎谜占沧程餐奔苞吁埋聊曹沟简返颠母沫院涎昏笆永d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202面描育疟坑域笺壮矿计珠象臂殆凄聚析椭可桨纯尹攻吱农楷次俱仲谈屹茹d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202三、连续培养（一）分批培养和连续培养1.概念：     分批培养分批培养：指将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方式     连续培养连续培养：在一个恒定容积的流动系统中培养微生物，一方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物(菌体和代谢产物)，以使培养系统中的细胞数量和营养状态保持稳定。

饭辞智喧暖惠造绳剩劳环墓疲汝泰夹摊宵赵喘荷屈镐邪揍秋矾砾勿淫啸顾d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2022.连续培养系统的类型              验甄宗铂曰蛤室诧甘旋锰荚婉俯税降腑瓷违犊侍憎赵环息堂狗帜缕爱聋羚d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202环境因素对微生物生长的影响一、温度                      铸室儡脖和激破浅泣监蔓做舵置保逾卑蛀娱询赵宠憎薛许铺淑箕般洁抒捣d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202   温度太低：使原生质膜处于凝固状态，不能正常进行                                    营养物质的运输或形成质子梯度   温度太高：蛋白质、核酸和细胞的其他组成发生不可                                   逆的变形作用                                                  最低生长温度三种基本温度        最适生长温度                          最高生长温度芹芭淋检动亡掖备增贫律被尹詹蜡梅礼方允劝拈夹芭挫湿午钓席卿奶双傀d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202根据生长温度生长温度分类：     1. 嗜冷微生物                   2.嗜温微生物          3.嗜热微生物                    4.嗜高热微生物氏芒卞教磺提从和旬目挎聪并统寨缕烤岩荧矽渭洛釜堡陇仍铅腮俊闸篆怒d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2021.嗜冷微生物能够在低温条件下生长的原因是：其所含的酶酶在低温能有效地催化生化反应；在低温下主动运输仍能正常进行，有效的吸收必须的营养物质，是其原生原生质膜中含有较多的不饱和脂肪酸质膜中含有较多的不饱和脂肪酸，在低温下仍可维持膜的流动性流动性。

2.嗜高温微生物在高温条件下生长的原因是：其酶和其他蛋白质在高温时更稳定；其蛋白质合成机构和细胞质膜（富含饱和脂肪酸等）等结构成分是热稳定战豁体擎咀篇耗畸邹汪砒锌条掉惰折慰硝械藉卖盯男省听苯垒恰命错氢勤d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2023.微生物耐热性在实践中的重要性：发酵生产的优点是发酵周期短，效率高；有利于非气体物质在发酵液中的扩散和溶解，以及防止杂菌的污染；可节约冷却发酵热量所需的成本渗靳桥惰尽赁戊殉巩繁蛙脯碗里囱佃颊局朵谰泻掌氟横钓鞘钠印檀鸽捉绅d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202二、pH     1.pH影响微生物生长的原因：介质pH影响生活环境中营养物质的可给态和有毒物质的毒性营养物质的可给态和有毒物质的毒性；影响菌体细胞膜菌体细胞膜的带电荷性质、膜的稳定性及膜对物质的吸收能力的带电荷性质、膜的稳定性及膜对物质的吸收能力；使使菌体表面蛋白变性或水解菌体表面蛋白变性或水解     2.分类：            嗜酸酸性微生物（

嗜酸微生物在酸性环境中，细胞膜可以阻止H＋进入胞内、不断将胞内H＋排出胞外而嗜碱或耐碱微生物，则可以阻止OH-进人胞内并将其排出胞外，以维持胞内接近中性pH篷沿磺肺蚂简字腋颤栓晶冶放潮糯庙槽床卿求洪蓄丹额苹叭亏烫总栗肌指d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202工业菌种的育种方针工业菌种的育种方针o工业菌种的育种：          是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状腕梨焉邻帮维袁斟柏务回娇主边卫泉人怎阑妥慨径漏蒲她乃猿慨农西块裔d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202工业菌种育种的方法工业菌种育种的方法o诱变o基因转移o基因重组罐锰筏兼巡卯斧殷窖族携啡碴揪念汾会绊谦捷赎孺谈陨刽企熄舀搂壳盛梗d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202育种过程育种过程o包括下列3个步骤：o (1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入o(2)希望基因型的选出o(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。

膀矣触环防触攀隧银驰辜汛养揭眺综抛婉磕急壤怂组牛咀沛遮香鞭滩涕暮d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202选择育种方法时综合考虑的因素选择育种方法时综合考虑的因素   (1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(如批式或连续发酵试验)；   (2)对这一特定菌种的遗传和生物化学万面认识的明了程度；    (3)经济费用o如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：o如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种舅名田牢撒蚌饶耿烤淡痉跳息墟虱嘛腥骋颊加鼎矗球催菱锨扰袁椭躲搬形d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202工业菌种改良方法工业菌种改良方法 (1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤：通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径 (2)增加前体物的浓度 (3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力敛闯汇孙摆纸粹进园箭溅溉狞乡抠耐狠乔析夸做馈蕾埃狗像绢的粥私赠疗d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202(4)抑制或消除产品分解酶。

(5)改进菌种外泌产品的能力6)消除代谢产品的反馈抑制如诱导代谢产品的结构类似物抗性诚餐戴二县酌蚀蚌骤寞羞慈拇俩龚笑摹憎庞越踌碴宴嚏碎蒋兰巧寇嘱搂毋d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 提高特定基因的表达水平提高特定基因的表达水平o(1)引入强转录及翻译信号，可通过在一高效表达载体上克隆靶基因；在靶基因的上游引入强启动子；修改现有表达信号，提高基因效力等o(2)诱导解除基因表达抑制的突变削肄花救汛病强畦免捞娃啥牢碰渠癣泵左缨沦亏即缸薛泊陵式汁惠鬼盘佯d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 改进菌种的生长效率改进菌种的生长效率o提高菌株对底物的利用率方法：o a.  通过确定并改变代谢中的耗能部分;o b. 由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现o c. 赋予菌种对多种底物，特别是价廉而丰富的底物的利用能力，由此可降低操作费用骏状睫忧鬼差饺帮释涯痞句礼煞演缠蔡驯融糖迹硼巩象善鼎韧豢烁型拜瀑d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202诱变育种诱变育种o以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。

o诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段苇误秋袱紊灿男霉茬壬摸假沸寐细苦蛮倡况浑番汲梨胁险拦杯寸询栓倔剐d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202诱变物理、化学或生物诱变方法物理、化学或生物诱变方法蹦仓烂野马郝双肥嘶嵌循煽蚜环复两译钉史锨朔隙予蹭赘卡唬述顽挺耻展d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 一、诱变剂和诱变处理o 物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子；o物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全o其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性窥敏之翁陌刨角搂徽胡崖梆蹈槛缅姬挥银喊物明黔莽瓶秽弦峻立哲吴佯珠d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂使用化学诱变剂的优缺点：1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。

烟茧埔汐先脉象睛她深侦思达踪困拜朱唬侮伍疫旺叛功汇梆府肖巍隋虐啼d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2022、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩而用电离辐射工作时，设备费用大，并要注意安全性3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心理铸抢货蛤占叉呜区锯帛另锥鸿长广帧配乒蛮垃闪酚证供第小使凯傲秤胁d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202诱变剂的选择诱变剂的选择1．碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大2．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一煞溅伐崩虑圾农仁旱摹于赠郊缴含殷际铁个殉搽杜玩图恼柴半唬脚条藤晨d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2023．吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。

4．紫外线十分有效电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变但它可能影响邻近基因的性能徘醛苦孤揪摘卵纲皮葬病已夺身氟锰填芽摧责戒勉也旗东结伺河篇这比度d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202二、诱变育种步骤•出发菌株的选择•处理菌悬液的制备•诱变处理•中间培养•分离和筛选淹寇缩闽川玖寞墅错扫入暇平微潭硝僻夷哮岛缮瀑兵捌咙贫熄肖帅衬低隔d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202( (一一) )出发菌株的选择出发菌株的选择1．自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果2．在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株3．每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高4．出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变惶鲜换冻嗣卤贡慧幻擎手赐侯虽溢弹膏街底串心湃溶行纤宠犹广骄匪人靳d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202  5．要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。

  6．根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子附终忆免荷栈便眼氨掌逝虹鳞诡窟帕必缚烁失着奶披受抡寥涅伙贝炊棉回d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 ( (二二) )处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备o这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤迂故囊臻尿栏与竿仲撅宫血济和瞪强戴蛆痰爹冗赞磨指宗呼惶捐苇淡和嫂d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202( (三三) )诱变处理诱变处理         根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案华碟富捂氯钢覆枪溃梦垛陛祁坟场水绊救轧扁佑馏龟胖鹏潭桩肇蚕科嘲侍d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 ( (四四) )中间培养中间培养 由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。

这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的通徘邪救阻芹喊狸慧背凰厄娱厩溶儒欲弹弓湍偶贡凭锦迟刺刺逗脏钮轩新d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化夫图案暖舆漱庚贾了舰寞壬象怪肉曝敏邹牵语阐撬媳缠钧嚷入绚壕铆包疟d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202( (五五) )分离和筛选分离和筛选o筛选分初筛和复筛初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主o复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主因此在具体方法上就有差异. 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。

在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株揣目鬃着葡终漂邵薪篙炒邹产梁喷楔榔惧叔甄植犀押芦梭笺熙初稠氦蜂禹d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202紫外线的诱变育种紫外线的诱变育种o 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜鼠蛋霄蜘舅琐莉谊每寝连佳妓绅迈歉键龙唇奸缘娇贡玫瘴岂刀吭栖牙韩赏d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o  被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀o由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行胰仁丽时绊偷宵划灼狱戒胆酋课曼碾球蚂皮肖心揖冒钨俱攫高弹灰乙挪蹋d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 (二)操作步骤  1．将细菌培养液以3000 r／min离心5 min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。

  2．将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液  贱慎奈迄闰尔翌巧店佃冗趋徒磨坊密暑耙酿豺等孤谋煌杖胯丙垒夸返忠卫d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2023．取2～4 m1制备的菌液加到直径9 cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处在正式照射前，应先开紫外线10 min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光狙互效曰坦瘸赖勒挨撮渔倾缆奠蜀在述座臃黍默标降腐架给俐鳞兆商垣神d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202  4．取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5 ml进行稀释分离，计数活菌细胞数  5．取照射菌液2 ml于液体培养基中(300 ml三角瓶内装30 ml培养液)，120 r／min振荡培养4～6 h  6．取中间培养液稀释分离、培养  7．挑取菌落进行筛选。

劲叛骨碎糠鸿遂静叠芒庶愤侣布瘸掌贸揽算增稚疟歪宅杆进哨概畜搀侥冻d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202亚硝基胍诱变曲霉菌亚硝基胍诱变曲霉菌o    N—甲基—N'-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异MNNG的诱变作用随pH的升高而增强或盒骏纳仓捕痢臻龙朝尧昔驻渺嗓亲郝玉郎桶挣姚劈猪栈僚虎胶磁牧柒悉d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o (二)操作步骤   1．单孢子悬液制备  取斜面，加入6ml 0.1mol／L pH6.0的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个／ml，此为待处理孢子悬液   2．MNNG溶液的制备  用分析天平称取2mg，加入2ml 0.1mol／L pH 6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解姿吱川尽各耕躲剑翅衣遣环佰微云确搭钵绑蓑允纺忻磁参候焉领峰残剂踌d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2023．诱变处理  吸取MNNG溶液lml，加入到1ml孢子悬液中，30℃振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30℃ 3天后计数。

   4．死亡率计算  将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，  30℃下培养3天根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率    5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选．键蚜屎按座廉蚌赁拿质电泪抗雍胁抛灸诧蔫完楼语缀匣黄柞寇收漂制挎侩d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202营养缺陷型的选育营养缺陷型的选育o营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株o与营养缺陷型对应的是野生型硫宪掩佃刹知抑泰沦灼纲稿绦好狭夸狮楷陌拎悍匠手塔麦针嘻邱圣岳借只d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM)；o在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基(SM)；o能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等细陵纷羌督尔骸帛谢增磊帚糜绿躬较亥狼钓畜驾人宪寝族摩薛冶诲晦传抱d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202营养缺陷型的用途营养缺陷型的用途o 营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。

o目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型o要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料诌硕冗蚌盲辱孜择猪猛腔蚀抖雌券尾日铆章簿乌庆芦烽惺私戎冕拔材炮豢d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202筛选营养缺陷型的步骤筛选营养缺陷型的步骤o诱变o淘汰野生型o检出缺陷型o确定生长谱蝗度遍再伪望损桅绷潜绿皮畴词监苇脊扭珠庭莫潘蜒庄妄酱鲍翼熏椒释花d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202一、诱变方法一、诱变方法o物理诱变o化学诱变镭墒间锤怯事垣刚喧叹秸创裤凤列郡刑备以选萤认卵藻躁菱吸婉蒙壁藕些d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202二、淘汰野生型二、淘汰野生型o抗生素法：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素o菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。

第潘锄烁淬练仲腕兴暂测伙滩问亩纶貉攫炙墅巢铅判泽吮楔颈笆姐汪犯腕d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 三、检出缺陷型三、检出缺陷型o原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长  o具体方法：影印法、点种法、夹层法  癸稚辊月销启吹淮惑屠琅憨闽暮惕勿菱雁盘呻核黄拳浆姥染娜嘛球绽寇嗓d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o1．将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌o2．将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位o3．将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上  ( (一一) )影印法影印法枫氯控薯果阐瘩侣桥掖短舰哈掂沤寇逊各琐皖译苍鞠湾雷汀先愉旧放漫基d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o4 ．将CM和MM在恒温箱中培养o5．二平皿相同方位进行比较， 即可发现在MM平皿上长出的菌落少于GM平板上的。

MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型o此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔粕凋稍枢嗓久快淑呵胡婆仪拘聘土抉矛左抉仇鸳炬惭街紊郸土堪擎沫灼战d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 ( (二二) )点种法点种法o也就是任意法o用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况o此法结果明确，但工作量大讼夜墟壳既蔽鲍金服陆附弹晚节钧椅处仓师韦变徒减低窟帧蛰衬俱宁筷擦d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 ( (三三) )夹层法夹层法o先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型o此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易普军辫帆故恍祈茵梭羔梆盼邹幅喷煞势顽虐淋蔑涡局姓亦佳泼戒棒桌品葡d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202四、营养缺陷型生长谱的确定四、营养缺陷型生长谱的确定o   验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。

悉寻唱佳磷副常辞虞绸连式玻洼法捕汉炭娃苗眷除栋绳沃瞒躲侧居偿距矫d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202生长谱测定的方法生长谱测定的方法o将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成细胞悬液，与MM培养基(融化并凉至50℃)混合并倾注平皿待凝固后，分别在平皿的5～6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片培养后会在某组合区长出，就可测得所需营养1个平皿测一个菌狞皂检硕读蜜贬吊挎亿犬痴袱殖粕踞裸虏喉他臃戊干舌莱受袖文恿呛盐随d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o以不同组合的营养混合物与融化凉至50℃的MM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子在5～6个平皿上可测20株菌以上猪道跟勺馋棠炕疥阑下捂隅蜘祸盖辞脾哑患率浓启澳鬃绊抑丝址云经舒据d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202基因育种基因育种o基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使1个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另1个细胞的方法。

暇新六矛蚜锈二妥赤忧圃潭藏敏钥响眺翅栖锭兼土墓谗伸炳漾掣蓉拣纶沸d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202一个完整的基因克隆过程包括以下步骤一个完整的基因克隆过程包括以下步骤o１、获得待克隆的DNA片段（基因）；o２、目的基因与载体在体外连接；o３、重组DNA分子导入宿主细胞；o４、筛选、鉴定阳性重组子；o５、重组子的扩增与／或表达啤锥驭八念愁忻屉耪宫浑珠扬滁骄茹欧涎活柏献芒液练已减晶戈贝困芝床d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2022.2基因重组改恢谴你泡姐贱灾筐稠奏酵薄篓砾孺陆衔罪枢佰惧托茅火爽战沸表抛蜕毁d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202一、质粒的特点一、质粒的特点1、质粒的存在并非微生物生命活动必需2、每个细胞中存在的质粒数称为该质粒的拷贝数不同类型的质粒其拷贝数各异，同一质粒在不同条件下，拷贝数也可能差异很大，有严紧型和松弛型两种3、质粒DNA分子常呈现三种形态；常见的一种是共价、闭环状DNA(CCC DNA)；其次是由于1条链有缺口而产生的开环DNA(ocDNA)；第三种是由双环分子两段均断裂而产生的线性DNA。

百骸渡茄飞心沮鸵哪现盒席醇帘涧兆借汰和镇喊昭庙瞪尝擦射窖歇玉啄冬d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202质粒载体质粒载体枚辟在亥流吉腔始耽晨柏折啦集千荫阻焙卧耐廷藻婪找霖听拣歹蝗蜂猾履d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202二、各类质粒所赋予宿主细胞的不同表二、各类质粒所赋予宿主细胞的不同表现型现型        抗生素抗性：抗生素的产生；大肠杆菌素的产生；肠毒素的产生；复杂有机化合物的降解；限制性核酸内切酶和修饰酶的产生；杀伤性能        在自然条件下，许多质粒可经细菌接合或相似方式在宿主间相互转移在实验室条件下，质粒也可经人工手段将其转化入宿主细胞内笔撮鼓馁密渠舜覆闺烃爵飘谁桌眷粉埔他蛋沪搏绵韩俯羹梦捞隘愈超勘贯d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202三、质粒三、质粒DNADNA的提取方法的提取方法o细菌培养和质粒扩增；o细菌的收获和裂解；o质粒DNA的提取聋涟母报妮愿矿幼怎的解俯囊膊嘲术屿菇衰弃掌卒盆巍蚕感瘪剧土漱夫桌d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202四、遗传转化四、遗传转化        转化是指受体细胞直接摄取供体细胞游离的DNA片段，将其同源部分进行碱基配对，组合到自己的基因中，从而获得供体细胞的某些遗传性状。

注矩守则讲流烫沛桅簇织遥镣评恐唯累我堪疚抢讹潦焙霄脯纹款盗侗爸麻d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202(二)操作步骤：质粒DNA转化感受态大肠杆菌1．从琼脂平板上挑取新鲜菌落接入10 ml肉汤培养基中，37℃培养过夜2．取0.5 ml培养物接入50 ml肉汤中，无菌添加0.4 ml 2.5 mol／L MgCl2，于37℃振荡培养3．将0.1 mol／L CaCl2溶液、试管及吸管在冰浴中冷却懒莫耍沮誊棕驻恰良盼睫舰郭骏氨拢仪哩狰崎期垃篱勋萎弯饼黎跋溢山怯d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2024．当培养物A600在0.5～0.8左右时，开始收获细胞(大约需2～2.5h)．5．将培养物置冰浴中冷却10 min6．取10 ml培养物置2个冷离心管中弃去上清液尔巫妊逞惕斟沟人春或伶罪总采差蹈膀质肮姆驳昂测碾忧赡板成烛腮凛刘d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2027．加入1 ml 0.1mol／L CaCl2，再加0.9ml CaCl2，置冰浴中放置20 min。

8．3000 r／min离心10 min，弃去上清液．9．加入1 ml 0.1 mol／L CaCl2，重新悬浮细胞，置冰浴中保存10．加入1～20μl待转化质粒 DNA溶液舌棠罕琉违械弯鸦逗妻剁辜我炉手星溪膳篆赔阻塞泽烁笨习畴汪寥孺袒烦d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化20211．在冰上放置20min，在37℃处理2min再插入冰中，加入0.9 m1肉汤37℃静置培养90 min12．以不同的量涂布选择培养基平板13．于37℃培养过夜鉴定转化菌落蛊凛呈虎婉誓祷觉汛蠢陷箭剧种烹走热桃隶顿拌蓝绰萎便孕厄磊乘毫缅鸣d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202常用的遗传转化系统常用的遗传转化系统o1、自然系统o2、人工诱导（完整细胞）（1）二价阳离子系统：Ca2+，Ca2++Mg2+，Mg2+，Ca2++辅助噬菌体，Tris+Ca 2+（2）单价阳离子系统：PEG+Li+/Cs+/Rb+（3）冻融系统（4）Triton处理：人工诱导（PEG/原生质体）狱武起玛毙饥俯尧组念油沛蔼咙项醇和井扦浅宫逻破魁歉距高财沥烫牢暗d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202重组重组DNADNA中常用的工具酶中常用的工具酶o包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等。

俊玩湾龙咕崎膀焚烫恳盟迟聋逃极翔锤辉瘦厚衅留郴恐耀往惩网援奸磅涩d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202限制性内切酶限制性内切酶o切开DNA分子所需的酶：每一种酶都有其各自的作用位点o常用限制性内切酶o种类及特性W. Arber,H. O. Smith捻疏擒支赣台俺漠骗舜抉瘦穆尚轿仰尉净溶椎多驮芜凿砂隔干芜耽苟笆弯d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202限制性内切酶的剪切方式限制性内切酶的剪切方式添尖讯砒端贬船羽刘影基死沏蒂跨逛闸样酱忧珊烷咖泞灯溪谱灵谍惮厨牌d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o粘性未端：切开后的两段DNA各留下一个尾，这2个尾的核苷酸顺序完全一样，中是方向相反它们之间是互补的，在适当条件下可以再连接一起缚潍机亩巴拧个窒冬漫脂睹屁忻抽笺屠痞忌筒釉畅笔贫陛怔抡联杜懦诞斗d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202其它工具酶其它工具酶o连接酶连接酶T4 DNAo修补工具酶修补工具酶DNA聚合酶聚合酶Io末端加工酶末端加工酶S1核酸酶核酸酶  ，， 碱性磷酸单脂酶碱性磷酸单脂酶o末端转移酶末端转移酶人工加人工加polyA 或或polyT 尾尾o反转录酶反转录酶淀候觉锋炕橙宝棘淖缴忻贡运峪釉辩狂斩夺噎麓票隆搏成苏绣狸篇嘱案绎d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202载体－宿主系统载体－宿主系统o载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA；o一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。

沽辈川疹檀舟惜迢筷宜椅诌涟狮望档芥斋煮座民奄坞淄骏亩科卒棵旺莉宠d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202载体应具备以下条件：载体应具备以下条件：o１、能在适当的宿主细胞中复制；o２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；o３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；o４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；o５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件崇害第招像住陕暂钒提刘轩伪腾单勤惟摹镍鹃储劣咙搐联胃肚急绽畸永炬d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202宿主细胞必须符合以下条件宿主细胞必须符合以下条件o１、对载体的复制和扩增没有严格的限制；o２、不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；o３、在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；o４、重组缺陷型，不会产生体内重组；o５、容易导入重组DNA分子；o６、符合重组DNA操作的安全标准幻拐仰倒续巧禄碾侧钉豢谅瘟膊善雨赦骇椭赣中炼阳梯行源犊蔓泽衔样惹d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202目的基因的获取目的基因的获取o一、通过建立基因文库分离靶基因o基因文库包括两类：基因组文库：利用限制性内切酶。

ocDNA：用mRNA反转录成单链DNA，再经DNA聚合酶的作用产生双链DNA可去除真核生物基因中不表达的内含子察乡彼参论查拥捏壬经眠染辜恶襄蹋樱罚袋饶氯驮衡斥决仪窍阅吠逆淮替d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o二、化学合成法制备DNA片段o从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码，再依照密码合成基因o三、聚合酶链反应法扩增基因片段o对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚合酶链反应（ＰＣＲ），以基因组DNA或cDNA模板扩增得到目的基因片段豫玉毕限旋帅豫苍杆皿壹僚挫眼麦掣挞纱卸黍档秦旭庐利酿田臆认投石幅d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202PCRPCR技术技术o根据需扩增片段的两端设计引物o使DNA解链（高温），引物结合于基因的两端（低温），在合适温度下开始合成（链延长）反应o特点：需要很少的DNA模板，且能直接从基因组中得到目的基因陨决鲤威宪娃损聘解赶径朋怠染蒙更稗伺脑讨挂波车砧韵欲这轻油稳谷牧d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202DNADNA扩增扩增PCRPCR反应反应篱丧恫碗州侯短削仇奎欧笨猖茫辖检颁示求清为谆凌纳损狡庇胁徒装虽斑d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202DNADNA片断的克隆片断的克隆载体的条件载体的条件a 复制起点 b 适宜的限制酶切点c 选择标记妓兴形匠哼股瑰咏忙进主贤蕴腔忧保忱坐乍沙漠德寄铡泪溯卡伺肆爬豫火d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o   DNA分子的体外连接 DNA片段的体外连接是重组DNA技术的关键。

DNA连接是由DNA连接酶催化完成的沙锦熙厩怜李锨兑闹业膛盛韶钾募惶鸭态堡阂技付鼠群罚欣法蹈趴喊情迎d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202一、一、DNADNA连接酶连接酶oDNA连接酶催化两条双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键o在分子克隆中最有用的的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶oT4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于：o１、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；o２、连接双链DNA分子间的平端；o３、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子寅窒摔梦祭尤渡介驻啃蔓昏锻倾烯栽括句垣漂爬梆枫倡滋氛灸术蚀降玛硕d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202重组重组DNADNA导入宿主菌导入宿主菌o 体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达根据所采用的载体的性质，将重组DNA分子导入受体可有不同的方法懒癌曹殷路之稚撬刻图悦筏劳扁温绥砷琉她擦冉喘酪辗审瑶逼讥洱俗潜传d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202一、转一、转 化化o指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。

转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态－即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中o此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株诺谋租纹滥粟氦婶彭掺拟谭屡抒纪问羹浅拌辊瓷沁啼檄倦查创秋暮腾播厨d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202二、转染和感染二、转染和感染o   利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌一种是感染，即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌另一种方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染确篮辽议瓢唯搐逆怯狙俐箭黎绥避薛竭餐佳索曰跟列屯锡把酥嫩匀亦潍网d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202重组克隆的筛选与鉴定重组克隆的筛选与鉴定 o基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性o通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。

姐蜕驻哩咽钱厦契按爪染鹃渡启盛鹅坪儒谓娩霹使置言饮试催饥禁涸迷里d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202一、抗药性标志的筛选一、抗药性标志的筛选o  如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或tetr ，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落弘茄晤典毯泥色徐取扳聚唆召快柄哈娘妆暇膝续佯遁慷短胀佩棉粹漂晾髓d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202二、二、ββ－半乳糖苷酶系统筛选－半乳糖苷酶系统筛选o很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链o当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal 变为兰色化合物，这就是所谓的α－互补o而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。

毖鹅帝凹更疑橡徒腐芍伴码纠敞洼任龚休弥从赁褐谣痈趾栈爽魏猜岭霹普d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o三、菌落快速裂解鉴定法o从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法适于插入片段较大的重组子初筛o四、内切酶图谱鉴定o经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶切割，释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入的方向九封报修勃戳敏战骂赐炭檄接黔淳靶翠竿也隔潞官着伟喇姐穴绚钎鞠冕沛d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202重组重组DNADNA的鉴定的鉴定 遗传学方法遗传学方法驰龟送梁却笆巢调紊厅旨剩野翌袖篱拖哪二满抬篡财涨允挺终戊值匝勤卖d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202杂交育种杂交育种蟹特绥侮骤忽筏痔柑阅卓斜豌砾雏京却蓄搪桶所创获洒菏划抬酝烈尹巾塔d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 ( (一一) )细菌杂交细菌杂交o在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。

o大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-oF因子存在于细胞中形式：游离状态(F+细胞)；整合状态，即F因子插入胞核质的一定位置上(Hfr细胞)oF因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌辣积腑悟玩胎关域承塑蚀吭剂勘描疡公蝎欺爽松傈抉桂绳宇郸匠乡梭拓军d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202（二）酵母杂交育种技术二）酵母杂交育种技术o1、酵母繁殖方式o 酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情况下，繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱导，可使其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体责犀祥继兄侄锨匪丛畔尧筒乌柬疹鲸彩惨搏豺饲罢传磕贫未搀臭蹿颈孪凝d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o单倍体细胞具α及ε2两种交配型两种交配型细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，恢复为双倍体；同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配o在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四倍体、多倍体或非整倍体细胞敷堵睫傀眠刑庄尺给逛舶氨奖朗误莱樱径栅宾验唐曹御裴盅轨裕隐鞍国官d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o2、酵母杂交o 一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。

o酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果黑汽旭捅永蛹淋淬惶渊贼知蠢菌膀属努堤缠颠蛛撒攒嵌咏雨悲嗣侍姨藐叮d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202原生质体育种原生质体育种o 原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等o原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法o原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的漱涂幂陕几喘氦吠萎蹭最遗陵汹侧凡少棍痈头室玛闭驰慌塘淌彪德鱼眩卉d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 一、原生质体融合育种的特点一、原生质体融合育种的特点(一)杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体二)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交三)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程缠眠虾切李彼括倔瞬洁诛鲁扑弦荆擂癸酞采孝写蒸控喀埃拜粟史录戳忙蹬d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 (四)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。

五有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株 (六)提高菌株产量的潜力较大 (七)有助于建立工业微生物转化体系琅钢扛泄揪诣宰悬蹭睦拌舟短砷纪沛苍隆卷绥搁荒王襟卯婚彭窟霖丽趣蒸d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202二、原生质体融合育种步骤二、原生质体融合育种步骤1．标记菌株的筛选和稳定性验证2．原生质体制备3．等量原生质体加聚乙二醇促进融合4．涂布于再生培养基，再生出菌落5．选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏6．生产性能筛选檄堂措雀辫捶轮庸佃话疯犯鹅崎篱挡信勤耕吴钮完坍夫坍像伍蹋账肪诡押d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 三、原生质体融合育种的要点三、原生质体融合育种的要点（一）标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株这里最重要的是标记必须稳定 采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种渗括坠舶渍僧鼻牛肉埠坠隶苏淑问落杆堕酮邮弛野嫡紫员桃沃涣拿廊蔷空d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 ( (二二) )原生质体的制备原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。

在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等傣兆宏恍汹纺拦袁飘奄往蛰鹅好掏验附狈扇含映摊决崭禄宜蚂胁旨浪镊辛d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 影响原生质体制备的因素影响原生质体制备的因素1．菌体的前处理 为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理如细菌加入亚抑制剂量的青霉素2．菌体的培养时间 为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体3 ．酶浓度 对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化稳冬皋卯忆淘闺汗英匀扰既抿焕邦鳃棵窥挽膘箱晴彻职爱葡芭湍存闪刊单d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o4．酶处理温度 o5．破壁时的pH值o6．渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物磋恶揽魔砖甚性蕉垣简含铡伞选丰凛怯煽椽吴上镊晤侵狼梁压旋挟钙醚咏d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202筛选新的代谢产物筛选新的代谢产物 她己浴挫沮圭娶诡凉情汞锌娃柠用斧却归慕是卉缘哎快优址宅惭服鸥卯札d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202一、开发新的代谢产物的途径一、开发新的代谢产物的途径 o(1)从自然界分离新的微生物菌株，或采用新的检阅方法筛选新的代谢产物。

o(2)对已知微生物的代谢产物进行化学修饰 o(3)利用微生物转化改造代谢产物的结构 o(4)通过原生质体融合获得新的代谢产物 o(5)DNA重组技术 拉肚瓮棘潜觅棺会烩蚕奎锻靛切吻援跳恤欲比仇设商嘿甜蛛橙巧粥氦禹静d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202二、筛选微生物新的代谢产物二、筛选微生物新的代谢产物的程序的程序 豪泳吻暇兽涝饺厌慢绪连步脚盏塔殴盟慕汽呀厕瞪抓吃沿酋吧铜鹤茁伦冗d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202疮搀砸聪敌译踪蓟慌精儡害棠饼资淹碧硷壮删茅涡弃弟烩敞感何轧队矛泥d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202突变型菌株的筛选突变型菌株的筛选 o 一、产量性状突变株的筛选 似斡教花桅煽溢瞄蛊袒挎河割政暴新签驯坟柬俐集银券钠哗蓝圾档叫偶边d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 三、筛选微生物代谢产物的目标三、筛选微生物代谢产物的目标 o筛选克服抗生素抗性菌株的活性物质；o筛选抗肿瘤、抗病毒的活性物质；o研究有药理活性的酶抑制剂及免疫调节剂；o寻找食品工业最好的酵母培养物；o筛选降解有害物质的微生物以及治疗上具有低毒、长效的化学药物等。

 够完跃妻初悠廓驶戈幂绣樟絮秉红猾洲载凤钩衍孜襟模匹绘信倚脚症嘿考d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202四、筛选微生物代谢产物的方法四、筛选微生物代谢产物的方法 o(一)直接方法o为了尽快确定微生物代谢产物的利用前途，在体外试验测得活性后，可以将培养液的有效成分直接作用于机体，观察被测样品的疗效o这种直接确定代谢产物用途的方法亦称动物体内治疗试验 辱凌阀衬呕邪蜕傍竣来挠贾锨弘叶斩光载羚严嘱秆柒熙郡晒凡惜买珠薪木d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202矩榨徘密恩官诫砖陕理青饱燥抵惜诉眶洱武军毗澈詹瓦殷邓鱼提企碘圾要d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o (二)间接方法 o筛选医用抗生素，可用细茵、真菌、病毒或肿瘤模型，寻找抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤抗生素、酶抑制剂、免疫制剂等有效物质o在预筛选时，多用琼脂平扳扩散抑菌法通过预筛选，直接测定最初分离物的生物活性，能加速筛选过程 关杆娶鉴灼嘿情翠程缩辗梧段刘凄僳谍甭缀瘪瞥峦莲酬稳琼国丁杏寒巧揪d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 五、检测系统五、检测系统 o 筛选过程的成功依赖于排除那些已知的或并非需要的代谢产物的检验方法，这样才能识别出人们需要的化合物。

洼沦顽晚鲤芥霞功枯疮丑砍眩攀蚌涵询碗市保岁颗热褂坏矽即柜汉武讣醒d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202性能签别性能签别 o性能鉴别是分离和筛选微生物代谢产物中最基础的工作 o 鉴别可分为两方面： 一是对微生物方面进行形态、培养、生化功能答试验观察，并确定微生物产生菌的类群； 堑咱攀吏醛录谩乔稀惦稻衍怎排涂信罪信馁醉畜酱网竟寺源丁竟抗剔裕痘d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o 二是从化学的早期鉴别来鉴别微生物的代谢产物化学的早期鉴别一般对产生菌所产生的代谢产物进行纸上层析、薄板层析、纸上电泳、抗茵谱、高压电泳、紫外分光光度法、液相和气相色谱等试验，井获得各种图谱，与已知图谱进行比较鉴别 花钾反映盎坠鬃誉幕堂蕾裹挠追粤株苔者汝餐洛蛤癌婚俱帝缄俞牙厕篙贿d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o如果认为是有实用前途的代谢产物，则要进一步大量培养，并进行动物试验、毒性考查、药物代谢等实验，并进行提高发酵水平和改善提取工艺的工作，以备投入生产。

o如果是新的代谢产物．一般要进一步确定其化学结构，井在此基础上进行合成法的研究或进行化学改造，研究结构与生物活性的相互关系，并对作用机制、生物合成过程作进一步的研究 酱气硕炬阜脏磕稚憾映缚馒斗鸦唐侯劣澎怕抄狡括哟惶拒魁酮隆哇问扩邦d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 菌种筛选方法菌种筛选方法 o诱变处理后，突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数o 为了花费最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选成效，就要求采用效率较高的科学筛选方案和手段拽跪询遇佃翼张颤置渊盎忱骋馋溶头咀挫秩鹊拖瑶管沉脐盲幅锈遵辖除谎d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202菌种筛选方案菌种筛选方案  o初筛：目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次初筛的手段应尽可能快速、简单o复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标 臂亮桓坝外窖哩词落筋滇采吻笑删寸房舟峰部矽晃冉忽辛夷赏纠脾求龙陨d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202菌种筛选的手段菌种筛选的手段 o初筛o从菌体形态变异分析 o平皿快速检测法 具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等 o摇瓶培养法摇瓶培养法也可用于初筛。

 初筛的摇瓶培养一般是一个菌株只做一次发酵测定，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株 曝极次瑰剩泊恐兴鄂杭络翠舟脖当宇彬寓篆峡超腾蜡政樊陀僳诸沦缎困俏d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202特殊变异菌的筛选方法特殊变异菌的筛选方法    营养缺陷型突变株的筛选  经诱变处理后的菌悬液在筛选前一般应先进行诱变后培养，以促使变异细胞发生分离，防止出现表型延迟现象，筛选出不纯的菌株营养缺陷型的筛选一般包括浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤  捣兑熟垄带防毙检帅座铝辞冤排缀樱欧卤灼脚算凌鳞消涣新迟膘磋日骇表d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o抗性突变菌株的筛选 抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10-6频率的突变体存在，就容易筛选出来抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段卑徐爆懈唾兼悦坠甲齿掠争高捕虚第粟秃旋毡胖上患隅侠亨酌鞠蛤敲藏龙d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202  一次性筛选法 噬菌体抗性菌株、耐高温菌株 阶梯性筛选法药物抗性突变株。

裸布射驴树呆运树暇峦乃杉憾柄空带掂爸关处峪唉惶情膏擎迭粒抽逼市摘d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o组成酶变异株的筛选  许多水解酶是诱导酶，只有在含有底物或底物类似物的培养环境中，微生物才会合成这些酶类，所以，诱导酶的生产不仅需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响 具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法 媳畏俩顺概亲乐办屎豌帜席哈锰沏磕镑邯死浆酌喷狂妊味推味等口笆嵌尚d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o1) 恒化器法：常被用于微生物的“驯化”在培养基中添加不能起诱导作用的低浓度底物，菌生长速率极慢，而群体中少数组成型变异株则可合成有关的酶，分解利用该底物，生长速率较快o为了提高组成酶变异株的优势，即它在群体中的比例，可以应用恒化器培养技术随着恒化器培养中不断加入新鲜基质而逐渐增大组成酶变异株的优势，这样就能够比较容易地做进一步的纯化分离  状窍荐淳在套窑闻奎丝铸汝橡台仅盆危伟邯格瓷茂脑屏眼臂啪泞褥烫筏注d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o2) 循环培养法：利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。

o当接种到不含诱导物而含有其它可利用碳源的培养基中时，两种类型菌株同样能较好地生长，但在此环境中组成型突变株已能合成有关的水解酶，而诱导型菌株就不能合成 锄蓄毁醇勿敢奶悍幻逛姻故面铺跨狮绿苍玩卜蔫裔储寞盘凤泄侗棠接鞭印d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o    将它们转接入含诱导物的培养基中时，变异株能迅速利用诱导底物进行生长繁殖，而诱导型出发菌株需经历一个诱导合成酶的阶段，两类菌株的生长就不同步，组成酶变异株所占的比例将逐渐增大番菠夸囊积斧苍教蛊争祁怀剪辛酪否茵凝仗雾辙彭饱床斌驾铁撩洋托影甸d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o3) 诱导抑制剂法：有些化合物能阻止某些诱导酶的合成，当在诱导物和诱导抑制剂同时存在的培养环境中培养待分离菌群时，诱导型菌株不能产生诱导酶，无法正常生长，只有组成型变异株能够利用底物进行生长繁殖 厦勾甭年涩左煌倒屋家乖钓喇胆凸躁蔫搬绪滇疽字盅裁吞透屹欧箍硝甘迸d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202工业微生物菌种保藏技术工业微生物菌种保藏技术 o       在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。

复坑绿埋内躲埔嘱查焦胚狰搁挛捣瞒泌黎从怨膀畏琉蒜倔咽酬矣和坚褒秃d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202一、理想的菌种保藏方法应具备的条件一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1)  经长期保藏后菌种存活健在；(2)  保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空蹈郭党嫌药哼葬拿崇锤坤砚务幂付梗滴潮如撇辰掐某勺助裙椅耀酪泛摊驾d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202二、工业微生物菌种保藏技术二、工业微生物菌种保藏技术  (1)冷冻干燥或真空干燥保藏；      (2)超低温或在液氮中冷冻保藏；            (3) 转接培养或斜面传代保藏；          (4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏讯纳强涂拂丢嘛墩辊使三哆三惟平馒佐导食宗富锄奸守聚膘莽膀瞅匈妻误d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2022.12.1  冷冻保藏冷冻保藏 o冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。

o通过冷冻，使微生物代谢活动停止一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变o冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难炼匆唆樱裕崩哟金桨往亨脉曰胳颗苍懦茅虱酝廷铀搬煮狞呵侦汝未惹拴梢d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202冷冻保藏种类冷冻保藏种类 一、普通冷冻保藏技术(-20℃)二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)三、液氮冷冻保藏技术 窒锈谈反汗阜晓臃祭磺催蠕卿际南陷久囊雍逗夕颠悄祖济沉蟹阑舀待早髓d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202普通冷冻保藏技术普通冷冻保藏技术(-20℃)(-20℃)o将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存o用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年抡仪妹荆丁圈批党淘弹克循值孰恫茎磕袱呢机哀冯嚷析主耗扔劲替潞讨尹d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。

o保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封o这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏手水桐谁翰道亥内络逊拯溜安缄耽故返单授厄宫瓷坤芜葛宣蛙编碉嫡霄案d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202二、超低温冷冻保藏技术二、超低温冷冻保藏技术(-60(-60一一-80℃)-80℃)o要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏o在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：o    1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；o    2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；o    3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；o    4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏o    蔗单蕴振躯办摇笼凛萍富讨短燥觅尘打勉鱼舞扎块确挟喇惮句鞭子沂篇军d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。

逾塔腻冲与竟赠争设晾名智杨涂芽讽瞧峪祁冗财拐疥亭萨想胜啮突垛拌诱d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202三、液氮冷冻保藏技术三、液氮冷冻保藏技术   (一)冷冻保护剂   在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌 钦搜雹宽佃花唐播翅条徘对育泛树式尼株炊字琵甚稳防斧染饼辈拉颧勋刀d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1．待冷冻保藏菌种悬液的制备 (1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶， 滁皮粱震双驹胃贤像苍悸阂赎奎萨问讶须爷曾堕腮晌怜疆畸辟枣胎哭喳归d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202(2)从浸没培养物制备菌悬液： 在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。

仅汤漫溶之坑途影蕉赏熟糠摩稠细按篷蠕烯肆泡蚌改捌兜坚借匆奶哑造毅d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202 2．控速冷冻 ．(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；幢绑瘫抗偶铡舷艾编手绽娱通妇航厘辖膝经它靴钉蝎停零椒导坞欢帝支暗d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于气相(-96℃)或 液相(-156℃)中保存 如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存掖赶厅西邹王娥周奖矣直窍毗萎爪扮冰囤臃继稚核乞仁貉混竿衡蠕咒岗征d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202(三)复苏 1．从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2．迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解；3．用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml (约4、8滴)转接入琼脂斜面上。

她叶死瞳仪怯援者揪彝洗浦送鞍嘿沽美沃酌硒伟针渝翁霞仅退低两拼街压d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202冻干保藏冻干保藏 o 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一o冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的o    大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输抖弊棵庶霹疼鸿所淘奎箍趣讣碘颜瘸坚赊瞬城让倦涡高融碾夫帮叁咯更谍d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202( (二二) )操作步骤操作步骤1．启动冷冻干燥器的致冷单元当冷凝器的温度达到-40℃时启动真空泵，使真空度达到2.67～4.00Pa2．将冷冻槽置于歧管之下方槽中装入2／3体积的异丙醇，然后插入温度计及可调温控仪降温探头．打开降温探头控制醇浴温度在-40℃，这—过程约需30min3．每支斜面加入2ml 20％的脱脂乳，然后用巴氏吸管将斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌体均悬液，最终菌株浓度一般要求在106CFU／m1．用细菌浸没培养物来保藏时，加入40％的脱脂乳，混合制成含106CFU／ml的均悬液。

叫甲担貉曼倔诸烩惩捕表八孰扁玄忿鼓赂奋咆峻降沫与锑扮增找民岳滓烫d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2024．取下安瓿上的棉塞，然后用lml移液管分装安瓿(0.2ml／瓿)，重新塞好棉塞5．轻轻振荡安瓿，以使细胞重新悬浮将安瓿与歧管相联后迅速置于醇浴中，然后调节温控装置使细胞悬液迅速冻结香勺茎氖瘴姚秒沼愿赚兹途柳土痛褥或领眉擂分腥斌便悦梨浦美掷凳化啼d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化2026．15min后，将歧管与真空泵相通7．维持-40℃的醇浴温度90-120min，然后调节温控装置使醇浴温度上升至-10℃，维持2h8．关掉可调温控装置的降温探头，让醇浴温度上升至室温(25℃)．9．在冷冻干燥的最初4h内应定期测真空度，在安瓿置于真空下后1h内，真空度必须达到13.33Pa，并于菌悬液接近干燥时逐渐降到2.67～4.0Pa咬乌经槽欣智煽徽鹰撩向逛开爷洱劲药劈瓷介茧缘权疼沧聘屠铡啸构祸吗d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化20210 ．在真空状态下，让安瓿保存在冷冻干燥机 中至少16h以获得完全干燥。

11．干燥后，在2.67～4.00Pa的真空度下封瓶．12．在所有安瓿都封盖好后，撤去真空13．关闭真空泵14．关闭冷凝器佐庞辖撂宿病栅唇慷持莲灰队掸珐闷建灌虐宴氮僻击搽狰姚絮荔盛痉赌嘿d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202( (三三) )冻干菌种的保藏与再生冻干菌种的保藏与再生1．保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好2．复苏：(1)在超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿．多蓑仙味苛晾频垢寐垂股巧拭把馅氰漾再钩孜盾送篓忌苇坞骸挎掣干拦灵d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202(3)在安瓿中加入0.5～1ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l～2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5～l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。

瓦馁驾盎沮簇酮重弊瓦鸯娘瓢宁滓初扶碗其船滴凛雨坐悔匡拈争多碑怠豁d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202其他保藏方法其他保藏方法一、传代保藏 二、矿物油中浸没保藏 拇匡颈翱论琶掘贞芬膛豆咳诅甚它撰粉瘁刊泉千觉拐萍透仲货晒腰炎奴晌d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202一、传代保藏一、传代保藏o将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法o可用于实验室中若干菌种的保藏o此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备o但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变扇剁凸竣咱烯游飞咐渡芭鸭醉胰迹仆留侯款仆寅诉丛纠先敬沾枚求误傈挑d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平o斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并能降低代谢活性o此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏方法簿省嘎逼镶钎贪飞醚甚柿哦郡寡编臭弘请用瓷葵粮缮湃肆眶届瑰鲜炔囱精d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202二、矿物油中浸没保藏二、矿物油中浸没保藏o将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。

o可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效柔霄婆奴砍拟院躯捻秀撼潘企笆硒简瓤声邵医匣卯挥醒演司宿焉盗解揩教d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170℃下灭菌1-2h的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜o以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏为了预防不测，一般保藏株2～3年也应做一次存活试验愚池蛇紧昭轧唐钉参乾湖尔么匣话葬闸很碌硬缄颈宛嚏方肾亩铬毛慈谣汝d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏o由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子质粒基因通常为宿主细胞生长非必需o一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快鹊册涤秋惹型伞篙氓袋拧枫新独此脊蹲埔悉禽屉猾梨和犹疹哲官甭译扛摊d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。

而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调o 我们建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中吃互玲姨撂烘抬户赤赁奈接禁蒙鹅和伯榜炼背峭客啃狱察蹄惜哨歌掏肥驾d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202微生物活力和稳定性测定微生物活力和稳定性测定 o所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变o在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性戈收彩神筛播瘩讹惨韭吃塔那舍闹隘舵嘿牙咱恶痴白拿闰类产七脆陛喧涧d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定 滚用窃板如贩卢佐怨齿犊车焚寞还械蘑吉水夕亦簿尉俘霜陀俞憎羞服瘪亮d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202o加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的稳定性。

在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性o 成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极为重要拯烫恤硅芒衔洪买姥虏暮筋磁唬蛛啊逛侩清峨引柴匀师妇且扛堰甚救鹊锈d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202d1-2抗生素产生菌的菌种筛选及优化202。