核酸分子杂交及PCR技术.doc

核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来 待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交 印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等三、核酸分子杂交的基本原理1、变性： 在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。

﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线增色效应： DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象DNA热变性现象　双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性增色效应和减色效应　当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性Tm与核酸的G、C含量有关 Tm=（G+C）%0.41+69.3 Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低2、复性在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。

﹡复性过程：第一步是两条单链随机碰撞形成局部双链，这种局部的双链是暂时的，若周围的碱基不能配对就会重新解离，一旦找到正确的互补区，则其局部双链形成核（成核反应），然后核两侧的序列迅速配对，形成完整的双链分子﹡影响复性的因素① 单链核酸的起始浓度：反应开始时的总浓度可直接影响单链分子碰撞的几率，浓度越高，复性越快② 核酸链长度（分子量）：分子越长，扩散越慢，形成配对的难度也大，复性也慢③ 核酸分子的复杂性：复杂性即核酸分子中不同序列的总长度，复杂性越高，形成正确配对的难度也越大，复性越慢④ 温度：温度过高有利于变性；过低则分子运动减慢，少数碱基形成的局部双链也不易解离适宜的复性温度是比Tm低25℃⑤ 离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于复性离子强度过高则不利于复性3、杂交﹡来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交﹡杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、DNA与RNA之间的杂交﹡核酸分子杂交技术：使已知序列的DNA或RNA片段上带上可检测的标记，可用来检测样品中未知的核酸序列﹡影响核酸分子杂交的因素：- 探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。

但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高也会增加非特异结合，使杂交背景增强探针越长扩散速度越慢；复杂性越高，配对难度也增大 离子强度：高离子强度溶液中，正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，削除相互间的静电斥力，有利于杂交分子形成 温度：通常在低于Tm 20-25℃的温度下进行杂交 添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸等，因其表面可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而加速杂交反应 杂交条件的严谨性：指杂交反应体系中，避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度它主要与杂交反应的温度、离子强度和洗膜的温度有关实际操作时，一般采用较低严谨性杂交以提高反应速率，以较高严谨性洗膜以尽量洗去非特异性结合和配对较差的探针，以提高特异性4、预杂交为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭在杂前的这些处理过程称为预杂交﹡常用于预杂交的封闭物：﹡变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层由于它们与探针无同源性，在杂交反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。

﹡高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖四、核酸探针1、定义： 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列 为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号﹡分子杂交技术的应用利用核酸探针，可以：F 通过同源性比较,研究不同物种或个体DNA之间的亲缘关系；F 通过杂交的严紧性,发现基因的缺失或突变；F 通过标记信号的强度,测定某种遗传信息量的多少；F 证明某种疾病(如肿瘤)是否与某种基因(如病毒基因)有关2、探针的制备方法探针长度一般以50-300bp为宜制备方法：1）利用DNA重组技术2）PCR扩增3）化学合成3、探针的分类：据制备方法及核酸性质不同，可分为：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针（1）寡核苷酸探针：由实验者设计、经核苷酸合成仪合成目前的合成仪均可合成70-100bp长的寡核苷酸，但一般常用的寡核苷酸针长18-30bp 优点：① 制备方便，实验者可根据需要自行设计，避免了天然核酸探针存在的高度重复序列。

② 由于大多数寡核苷酸探针长度只有15-30bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度因此它特别适用于基因点突变分析③ 比活度高，适用于大多数杂交，如DNA序列测定、Sounthern、Northern原位杂交等缺点：探针短，与靶序列形成的杂交体稳定性差，对杂交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难度大；探针特异性差，背景噪音也大 （2）基因组DNA探针：利用机械剪切或限制性内切酶消化基因组DNA制备成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当的载体中，转化宿主细胞，构建成基因组DNA文库，进而进入文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆，经扩增、提取DNA、酶切及电泳分离，即可得到足够量的基因片段，经适当的标记后，即可作为探针使用PCR方法也可制备DNA探针在选择此类探针时要特别注意真核基因组中存在的高度重复序列要尽可能使用基因的编码序列（外显子）作为探针，而避免使用内含子及其它非编码顺序，否则探针中可能因高度重复序列存在引起非特异性杂交而出现假阳性 基因组DNA探针 从基因组DNA文库中选取某一基因片段↓与载体连接（质粒、噬菌体）↓克隆(PCR扩增)↓酶切优点：①无性繁殖、制备方法简单；②不易降解（与RNA比较）；③标记方法成熟。

（3）cDNA探针：由mRNA转录而来，在逆转录酶的作用下，以mRNA 为模板，合成cDNA第一链，进而合成第二链将合成的cDNA插入到适当的载体中，构建cDNA文库，然后筛选适当的阳性克隆，再进一步扩增、酶切及纯化该cDNA片段即可优点：双链探针，长度较长，可与靶序列形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高，杂交信号强缺点：由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过程中还存在自我复性现象 cDNA探针（complementary DNA）通过逆转录↓双链cDNA↓ S1核酸酶切平两端加接头 ↓ 限制酶 粘性末端↓载体连接↓克隆（4）RNA探针：以双链DNA为模板，利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶于体外转录而成优点：①RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高 ②单链，不存在变性和自我复性 ③RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交少 ④杂交后可用RNase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低 缺点：RNA容易降解4、探针所携带的标记物应具备的条件：﹡标记后的探针的分子结构要尽可能与原来的分子结构相同，绝不影响其碱基配对特异性，不影响探针分子的主要理化特性，尤其是杂交特性。

﹡标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高﹡稳定性好、环境污染少、价廉5、常用的探针标记物：﹡放射性同位素：3H、32P、35S、125I等﹡非放射性同位素：地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等6、探针的标记方法（1）缺口平移法（2）随机引物标记法（3）末端标记法（4）生物素光照标记法﹡缺口平移法的原理- 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的5`→3`的聚合酶活性和5` →3`的外切酶活性相结合 首先用DNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于E.coli的DNA pol I的5`→3`外切酶活性，切去带有5`-磷酸的核苷酸；同时利用该酶5`→3`聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口 - 这两种活性同时作用，缺口不断向3`方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针 切口移位（平移）法﹡随机引物标记法原理用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`- OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。

﹡末端标记法原理（1）一种是在5`末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP转移加到DNA片段5`-OH上2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTP﹡生物素光照标记法光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的DNA探针7、探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针习题1　DNA分子受热变性时，其特征是(　　)　Ａ．碱基间的二酯键断裂　Ｂ．形成超螺旋　。