双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验.ppt

双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微 镜上的应用经验浙江大学生命科学学院 仪器与技术服务平台机型：Zeiss LSM710 nlo32通道阵列PMT690-1080nm可调谐飞秒激光器激光共聚焦显微镜的非常规应用• 利用双光子分辨目标荧光和自发荧光 • 利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假 • 转基因材料快速筛选 • 嘈杂背景下的细胞计数 • 非线性效应 • 光刻和深度扫描 • 模拟近红外光源GFP标记水稻根中自发荧光的清除单光子激发，水稻根带有强烈的黄绿色 自发荧光双光子激发，自发荧光为蓝色ex 488nm，Lambda modeex 820nm , lambda modeGFP标记水稻根中自发荧光的清除•双光子激发下GFP荧光与自发荧光 的波长分离，820nm激发时，仅采 集493-542nm区间的信号以保证特 异性Ex 820nm, channel mode 微弱或自发荧光存在下的信号鉴定Promoter::GFP载体注射烟草叶片（lambda mode成像）转GFP弱表达转GFP不表达镜下目视特征： 绿色信号被强烈红光掩盖 GFP和RFP弱时无法分辨Lambda合成图特征： GFP：绿色偏蓝 自发荧光：绿色偏黄 叶绿素荧光：红色光谱特征： GFP： 主发射峰位于约518nm 副发射峰位于约540nm 后者高度约为前者的一半 呈台阶形 自发荧光： 在560nm左右对称分布 叶绿素荧光： 625nm以上强烈信号GFP叶绿素转基因材料的快速筛选原则：密集预排列待测样技巧：lambda扫描 色彩判别 荧光峰形检查GFP蓝绿特征色GFP台阶形特征峰518540土壤浸出液中外源GFP标记细菌浓度分析目的：了解土壤中的不同细菌间的竞争关系方法：等比掺入外源GFP标记菌体，设置多种 环境条件问题：土壤标本背景嘈杂，往往带有各种带荧 光的杂质颗粒解决：1 固定样品体积2 lambda成像检测GFP特异荧光3 最大化pinhole非线性效应：碳纳米管498518421 原理：某些材料在双光子 激发，会发射波长为激发 光一半的荧光利用不同波长的双光子激光照 射可能含碳纳米管的靶向药物 ，lambda扫描发现荧光信号呈 现严格的倍频关系Ex 850Ex 1000Ex 1040光刻和深度扫描一种人工合成的透明有机晶体， 在一定强度的近紫外光下会发生 局部变性，从而具有双光子效应在2个不同Z坐标下做bleach， ex 458nm ex 900nm 做z-stack，显示多层 光刻效果，信号随深度增加而衰 减叶表面蜡质层成像及厚度测定菲（多环芳烃类）渗透 Ex 700nm Channel mode Z-stack谢谢大家。