培养材料的灭菌与接种-植物组培.jsp.doc

实验3 培养材料的灭菌与接种 一、实验目的 培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中一个很重要的环节通过实验，领会无菌培养对试验材料消毒、接种的要求，初步掌握材料灭菌、接种的操作技术 二、实验用具和药品 净化工作台(或接种箱)、镊子、解剖刀、解剖针、称量瓶、广口瓶、酒精灯 0.1%氯化汞(升汞)、漂白粉(饱和上清液)、次氯酸钠、70％酒精、灭菌蒸馏水 三、实验材料 植物的茎顶、芽段或花药等 四、接种前的准备 (一)培养基准备按培养材料的要求，配制好培养基植物器官和组织培养常用的培养基有MS，LS，Miller，Nitsch， White，N6等 (二)接种室准备 首先将接种用具、无菌蒸馏水、培养基等置于接种台上，打开接种台开关，确认接种台正常送风后，开机30min然后，向台内用喷雾器喷洒70％酒精或用紫外线照射15min进行灭菌 五、培养材料的表面灭菌 培养材料的灭菌原则：培养材料的表面灭菌，是组织培养技术的重要环节培养材料进行表面灭菌时，一方面应考虑到药剂对各类菌种的杀灭效力，从中选择具有高效的杀菌剂；另一方面还应考虑到，植物材料对杀菌剂的耐力，也就是说，不能因选用了强杀菌剂而使植物组织、细胞受到损伤或杀死。

至于选用几种药剂进行表面灭菌，灭菌的时间长短，应依据作物种类的不同进行灭菌试验 培养材料的灭菌方法： 芽段：从田间选取生长健壮、无病、虫害嫩茎、嫩枝，酌情用水冲洗干净后，放入广口瓶中 花药：选择单核期的花蕾，放入称量瓶中 进行下面两种处理：(一)芽段 先倒入70％酒精，摇动两三下(6-7s)，立即将酒精倒出，然后倒人0.2％氯化汞液，浸泡10-15min (二)花药 先倒入70％酒精，摇动两三下(6-7 s)，立即将酒精倒出，然后倒入饱和漂白粉上清液(或次氯酸钠)，或0.2％氯化汞液浸泡8-10min浸泡过程中不断摇动，然后在接种台上用灭菌蒸馏水洗三次，接种六、培养材料的接种 (一)接种前用肥皂洗手，特别是将手指冼净，然后用沾以70％酒精的棉球把手和指尖消毒1次 (二)解除三角瓶上捆扎包头纸的线绳，把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用70％酒精棉球把接种台面擦一遍(清除尘粒) (三)将接种所用的大小镊子等，沾以70％酒精，在酒精灯火焰上，灼热灭菌灼热灭菌后放在支架上，注意不可再行污染 (四)轻轻打开包头纸，去掉瓶塞，将三角瓶口在火焰上方灼热灭菌(瓶口转动一圈)、然后置酒精灯右侧。

(五)材料处置 (1)芽培养用镊子取出嫩茎置于培养皿内，重换一把镊子，剥去芽上的鳞片，切下1cm长带一个芽的芽段，芽最好位于芽段中央，将芽段放人三角瓶内的培养基上 (2)花药培养用镊子取花蕾一个，左手捏住花托，右手用小镊子剥开花瓣，换一把镊子取下花药(切勿带花丝)放人三角瓶内培养基上每瓶接花药若干，接种数目根据花药大小而定 七、培养材料的置床 在酒精灯上方，左手握住三角瓶，右手用镊子在培养基表面将培养材料摆放均匀(芽段平放于培养基上，注意芽的部位向上，用镊子将芽段轻轻向下按一下，使枝段的一半进入培养基)在酒精灯火焰上转动三角瓶一圈使瓶口灼热灭菌然后用纸封口，在包头纸上写清材料名称、培养基代号、接种日期、姓名等注意在超净工作台接种时，应尽量避免做明显扰乱气流的动作（如说笑，打喷嚏），以免气流紊乱，造成污染八、作 业接种后的污染调查 芽段或花药接种一周后，调查污染情况并将调查的结果填人表内：观察日期：接种日期 接种数 污染数 污染率（%）。