微卫星分子标记在海洋动物遗传分析中的应用.pdf

? ? ??≥? ? ? ?? ? ? ?∂? ?? ???? ?? ????????微卫星⁄??分子标记在海洋动物遗传分析中的应用?ΑΠΠΛΙΧΑΤΙΟΝΟΦ ΤΗΕΜΙΧΡ ΟΣΑΤΕΛΛΙΤΕΤΕΧΗΝΙΘΥΕΦΟΡ ΓΕΝΕΤΙΧ ΑΝΑΛΨΣΙΣ ΙΝ ΜΑΡΙΝΕ ΑΝΙΜΑΛΣ刘志毅相建海?中国科学院海洋研究所 青岛???????分子遗传标记的研究一直是 遗传学研究中的一个热点∀目前? 各种分子遗传标记的研究在陆地 生物学中已深入开展?在海洋生物 学中分子遗传标记的研究也是方 兴未艾∀在各种分子遗传标记中? 微卫星⁄? ?标记的研究则受到许 多学者的青睐∀微卫星⁄? ?标记以 其特异性的°≤?扩增!稳定性!重 复性好!能较好地反映物种的遗传 结构和遗传多样性变化等特点?日 益受到研究者的重视∀?微卫星⁄? ?的概念和 特征微卫星⁄? ?是指核心序列 为?∗ ?个的寡核苷酸经多次重复 而形成的串联重复的⁄? ?序列?如?≤??ν ,?×??ν等?又被称为短串联 重复序列!简单序列重复∀有的学 者也认为核心序列核苷酸数小于??的短串联重复序列即可认为是 微卫星⁄? ? ∀微卫星⁄? ?重复次 数及重复程度的差异是造成每个 基因座位的多态性的原因∀微卫星⁄? ?广泛分布在真核生物的基因 组中∀与限制性片段长度多态性! 可变串联重复相比?微卫星⁄? ?在 基因组中的分布更为随机?所显示 的多态性也更高≈??∀微卫星⁄? ?呈 孟德尔共显性遗传模式?可以区别 纯合显性个体和杂合显性个体?这 为遗传研究提供了更多的可供分 析的信息∀一般说来?微卫星⁄? ?的重复序列两侧都有物种特异性 的侧翼序列?根据这一特异性序列 可以设计引物对基因组⁄? ?进行°≤?扩增?从而检测物种在⁄? ?水 平上的遗传多样性∀?微卫星⁄? ?标记的筛 选和遗传信息的分析微卫星的筛选是微卫星标记 研究中关键的一步∀通常获得微卫 星⁄? ?序列有两大途径?一是通过 检索⁄? ?序列数据库获得?二是通 过具体的⁄? ?序列分析实验获 得∀一般获得微卫星序列的实验方 法有下述几种∀?? ?从基因组文库中获得含有 微卫星⁄? ?的阳性克隆这是目前大多数研究者所用 的方法?如张亚平等在????年?徐 磊等≈??所报道∀首先构建某一物种 的小片段?几百个? ?左右? ⁄? ?文 库?利用同位素标记的寡聚核苷酸 探针去筛选文库中的阳性克隆∀然 后?对阳性克隆进行测序?确定微 卫星序列∀有的研究者则直接对小 片段的重组克隆载体进行测序和 分析∀根据? ? ÷∏等人≈???的报道? 他们对斑节对虾? Π εναευσ µονοδον? 的??个重组克隆中的??个做了直 接测序?得到了??个微卫星序列∀ 同时指出?如果杂交反应条件十分 严格的话?用常规的杂交筛选的方 法往往得不到较小的微卫星序列?而如果杂交条件相对温和的话?则 可以得到更多较小的微卫星序 列∀?? ?从? ?°⁄标记中获得微 卫星⁄? ?首先按? ?°⁄方法对某一物种 的基因组⁄? ?进行°≤?反应?扩 增产物经电泳后转移到硝酸纤维 素膜上?用某一重复序列作为探针 与其进行杂交?确定产生信号的位 置?然后从电泳胶上找出相应的片 段进行分离!纯化!测序?即可获得 这一物种的微卫星⁄? ?序列∀这种 方法有时可能需要进行多个随机 引物的°≤?反应及≥?∏ ? ? ? ? ?杂交 的操作∀?? ?°≤?扩增测序法这种方法避免了放射性同位 素的操作∀其主要原理是将基因组⁄? ?用限制性内切酶消化后的小 片段与质粒相连?用含有特定重复 序列的寡聚核苷酸和质粒上的特 异性序列?如外源⁄? ?的插入位 点?作为引物进行特异性°≤?扩 增?从中筛选出可以产生扩增产物 的质粒?对扩增产物的片段大小等 性质进行分析?结合质粒上特异性 序列的位置?就可以确定微卫星?国家自然科学基金资助项目?????????号和国家???计划资助项目???????????号∀ 收稿日期? ???? 2?? 2???修回日期? ???? 2?? 2??≥≤?∞?≤∞ ≥≤ ?°∞ 科学视野海洋科学?????年?第??卷?第?期??⁄? ?在质粒上插入片段的大小及 位置?对质粒上插入位置和片段大 小合适的外源⁄? ?序列进行测序? 即可获得微卫星⁄? ?序列∀ 根据微卫星⁄? ?两端的保守 序列可以设计特异性引物?扩增这 个位点的微卫星⁄? ?序列?经聚丙 烯酰胺凝胶电泳即可显示不同基 因型个体在这个微卫星位点上的 多态性∀由于扩增出的°≤?产物片 段都很小?基因型之间的差异也很 小?所以通常使用聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离扩增片段∀但此操作需使 用放射性同位素?因此又有人提出 用银染法代替同位素操作?还有人 用高浓度琼脂糖凝胶??? ∗ ?? ? 电泳来代替聚丙烯酰胺凝胶电 泳∀ 由于微卫星⁄? ?扩增是特异 性扩增?因而实验结果的重复性及 稳定性都比较好∀微卫星⁄? ?标记 是按孟德尔方式遗传的?这种由保 守序列确定的位点可以检测出复 等位的差异?表现为共显性∀据此? 我们可以计算某个基因型频率?进 而计算种群的?平均?遗传杂和度以 及其他遗传学指标?从而了解种群 的遗传结构∀我们也可以利用微卫 星⁄? ?标记分析物种的遗传多样 性?同时微卫星⁄? ?标记还可用于 遗传连锁分析?构建遗传图谱等等∀?微卫星⁄? ?标记在海 洋生物遗传分析中应 用日益广泛微卫星⁄? ?标记在理论和实 践上都具有重要意义∀微卫星⁄? ? 作为一种分子遗传标记?其位点的 多态性使其具有较高的信息量∀此 外?微卫星标记是一种较为合适的 中性遗传标记?因为一个标记如具 有高度选择性?则就不再具有广泛 的标记作用∀现在微卫星标记在种 群遗传结构分析!物种遗传多样性的鉴定!遗传图谱的构建中都有广 泛的应用∀在海洋生物?尤其是经 济海产动物分子遗传学理论与应 用结合的领域中?分子标记研究成 为近年来研究的一个热点∀?? ?种群遗传结构分析 种群遗传结构的研究?从最初 基于形态和生理生化的孟德尔性 状的描述?进入到以分子生物学手 段为主更加精确的定性定量研究? 是一个巨大的飞跃∀期间涌现了许 多方法?如? ƒ? °!? ?°⁄!?ƒ? °!? ? ⁄ 2? ?等?这些方法均以物种的⁄? ? 多态性为基础∀微卫星⁄? ?的发现 和作为遗传标记在生物遗传分析 中的应用?无疑为种群遗传结构的 研究又提供了一个有力的工具∀微 卫星方法与? ?°⁄手段相比?在不 同实验条件下都具有很好的稳定 性?且提供的多态性信息也十分丰 富?是一种较为理想的分子标志信 息∀而且?在个体水平上的遗传结 构的分析?微卫星标记要优于其他 一些方法∀但是也应看到?对物种 进行遗传分析?仅仅依靠一两种手 段是远远不够的?根据不同的研究 目的将微卫星⁄? ?标记与其他方 法结合起来?才能更为有效地对遗 传结构作出分析?进而为生产实践 服务∀ 利用微卫星⁄? ?的孟德尔遗 传特性及共显性的特征?我们可以 通过分析基因型特征来确定种群 的遗传杂和度?同时可以进一步描 述种群的遗传结构∀?? ? ? ? ? • ? ? ? ∏ ? 等≈??将微卫星标记应用于对虾的养 殖选育计划?对高健康虾品系中的?个地理种群共??个家系???尾 对虾进行了微卫星??的分析∀阐 明了每一家系的亲代与其后代之 间的遗传关系∀共获得了??个不 同的等位基因位点?并且还比较了 种群的预期及观察遗传杂和度?确 定了??个种群特异性标记探针? 其中有?个标记是来自墨西哥≥ ? ?? ?? ?种群的一个家系所特有 的∀这一研究为高健康虾品系的选 育及监测种系内的遗传变异程度 提供了理论依据和指导∀在水产动 物选育研究中分子标记手段的运 用还不普遍?利用分子标记可以更 加精确地描述被选育对象的种群 遗传结构?是迅速有效地实施品种 筛选工作的有力工具∀ ?? ? ? ? ?• ? ? ? ∏ ?等人在这方面的工作无疑 提供了微卫星分子标记在分析种 群遗传结构?进而应用于生产实践 的一个很好的例子∀此外ƒ? ???? ? ? ? ?? ?? ? ??等人≈??也将微卫星标记应用于鲈鱼的遗传育种计划∀另 外?研究者们对龙虾? Η οµαρ υσ? ? ?? ?≈??!真鲷? Π αγρ υσ µα ϕ ορ ?≈??!大西洋鲑鱼? Σαλµο σαλ αρ ?≈??的不同种群?或种类?都进行了遗传结构方 面的比较研究?为遗传育种!种质 鉴定!种苗放流等提供了一定的理 论依据∀?? ?物种遗传多样性的鉴定 生物多样性问题现在已成为 人们关注的焦点之一∀生物多样性 可以定义为所有活的生物体中的 变异性?包括陆地!海洋和其他水 生生态系统及其所构成的生态综 合体?它包括物种内多样性!物种 间多样性!生态系统的多样性?个 层次∀生物多样性的保护和可持续 利用是维持全球经济稳定和发展 的重要因素?也是保持我们赖以生 存环境的重要内容∀精确地评介生 物多样性水平?能为生态资源的保 护提供理论依据∀如前所述?从形 态!细胞!生化!分子等不同层次上 可以揭示物种的变异性∀近年来各 种分子标记的发展和应用?以及比 较基因组学的兴起为这一工作的 深入开展提供了有力的工具∀其 中?微卫星⁄? ?标记技术已成为检 测物种遗传多样性的一个重要手 段∀目前?在国外这一技术已应用 于牛!羊!马?小麦!水稻等重要的≥≤?∞?≤∞ ≥≤ ?°∞ 科学视野?? ? ? ??≥? ? ? ?? ? ? ?∂? ?? ???? ?? ????????动植物研究中?在鲈!鳟!牡蛎等水 产动物中也有报道≈??∀这对种质资 源的评估!分子标记辅助育种!品 种的选育都具有重要意义∀?? ∏ ? ? ? ?°?≥?? ? ?等人≈??用?种微卫星位点 对加拿大不列颠哥伦比亚省的一 种鲑鱼Χ οηο σαλµον的??个地理群 体的遗传杂和度做了比较分析∀他 们的结果显示了这?个微卫星位 点具有很高的多态性?分别在Ο τ σ???? Ο τ σ?和Ο τ σ???位点上确定 了??? ??和??个等位基因∀通过对 遗传距离的分析?指出有?个地理 群体已具有一定的同源性∀他们同 时对这些群体做了系统树分析?认 为这个系统树反映了不列颠哥伦 比亚省Χ. σαλµον群体的地理分布 特征∀≥?? ? ?等人指出?对种群结构 进行精确分析有助于在同物种的 种群水平上对Χ. σαλµον资源进行 评估和管理∀严格来说?对物种多 样性水平的检测同物种遗传结构 分析是紧密相连的?对物种多样性 水平的评估可以说是遗传结构研 究的继续深入∀目前?微卫星标记 应用于海产物种的遗传多样性分 析和种质资源评估这些方面的研 究还不是很多? ≥?? ? ?等人的工作提 示了分子标记作为研究物种多样 性主要手段的重要性∀?? ?遗传图谱的构建 利用微卫星⁄? ?标记?可以 进行遗传连锁分析?构建遗传图 谱∀在陆地许多生物中?包括人!大 鼠!牛!羊等动物的基于微卫星⁄? ?的连锁图谱已逐渐发展起来? 在植物中?科学家们已将微卫星⁄? ?标记添加到大豆!大麦!水稻! 玉米等物种的以? ƒ? °为主的连锁 图上∀与陆生饲养动物相比?水产 动物驯养育种还处于起步阶段?编 制出与重要经济性状相适应的遗 传图谱对于品种选育!种系评估都 具有重要意义?同时也将使水产动 物养殖驯化工作变得更加容易!快 捷?从而为优良种系的构建提供可靠的理论依据∀然而?水产动物基 因图谱的研究工作尚处于萌芽期? 直至近几年才启动了重要经济水 产动物的基因组图谱的国际合作 研究∀????年?月在美国召开了水 产养殖生物基因组图谱研讨会?确 定了罗非鱼!鲶鱼!鲑鳟鱼!牡蛎及 对虾?大养殖种类为基因组图谱 的研究对象∀在鲑鳟鱼类? ×? ? ? ? ? ?≥? ? ??? ? ?等人≈??用??个微卫星标 记研究了与虹鳟产卵时间连锁的 数量性状位点?在?个连锁群中确 定了??个数量性状位点∀他们用 产卵实验对?个连锁群中的?个数 量性状位点进行验证?均得到。