种子生活力与活力测定.ppt

第四章 种子生活力与活力测定­第一节 种子生活力测定原理及方法­第二节 种子活力测定原理及方法第一节 种子生活力测定原理及方法­一、概念及意义­1、种子生活力是指种子发芽的潜在能力或种胚所具有的生命力­2、种子生活力测定在农业生产上具有重要的意义：①测定休眠种子的 生活力②快速预测种子的发芽力③是种子生理研究的方法­3、种子生活力测定方法分类：­①生物化学法，如四唑法、溴麝香草酚蓝法、甲烯兰法、中性红法、二硝基苯法等；­②组织化学法，如靛红染色法、红墨水染色法、软X射线造影法等；­③离体胚测定法；­④荧光分析法­本节主要介绍四唑法、离体胚测定、染料法和软X射线造影法­二、四唑法­（一）四唑法概述­四唑法于1942年由德国H.Lakon教授发明ISTA于1953年将四唑测定列入国际种子检验规程四唑测定适用于下列范围：­（1）测定休眠种子的发芽潜力；­（2）测定发芽试验末期未发芽种子的生活力；­（3）测定种子收获或加工过程中的种子损伤（如热伤、机械损伤、虫蛀、化学伤害等）原因；­（4）解决发芽试验中遇到的问题，查明不正常幼苗产生的原因和杀菌剂、种子包衣等处理的伤害；­（5）查明种子贮藏期间劣变衰老程度，按染色图形分级，评定种子活力水平；­（6）调种时时间紧迫，快速测定种子生活力。

­（二）四唑法测定原理­有生活力的种子活细胞在呼吸过程中都会发生氧化还原反应四唑溶液作为一种无色的指示剂，被种子活组织吸收后，参与活细胞的还原反应，从脱氢酶接受氢离子，在活细胞里产生红色、稳定、不扩散、不溶于水的三苯基甲 化学反应式如下：­DPNH2 + TTC DPN + TTCH + HCl­(辅酶IH2) (四唑) (辅酶I) (甲 ) (氯化氢)­依据四唑染成的颜色和部位，即可区分种子红色的有生活力部分和 无色的死亡部分 ­注意：四唑染色是一酶促反应，因此反应不仅受酶活性的影响，还 受底物浓度、反应温度、pH值等因素的影响­该酶促反应的适宜pH为6.5－7.5，高于或者低于此pH值，反应不能正常进行，也就无法测定种子活力的高低因此，对于游离酸含 量高的四唑试剂应当用缓冲液配制­反应温度，反应速度随温度的不同而变化，温度每提高10℃反应速 度提高一倍，譬如20℃时需要反应时间4小时，在30℃时则需要2 个小时，但反应最高温度不能超过45℃­染色时底物的浓度要一致，一般染色部位切开的种子，测定时四唑 溶液的浓度为0.1％－0.2％，染色部位完整的种子，浓度为1％－ 2%。

种子预措时，采用的方法应根据种子的化学组成和种子结构确定­ 四唑盐类有多种，最常用的是2,3,5-氯化（或溴化）三苯基四氮唑，英文名为2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride (or Bromide)，缩写为TTC（TTB）或TZ，分子式为C19H15N4Cl，分子量334.8，亦称红四唑，为白色或淡黄色粉剂，溶点243℃，当达到约245℃就会分解，易溶于水，具有微毒试剂在光下会被还原成粉红色，因此需用棕色瓶盛装，且瓶外要裹一层黑纸同样，配好的四唑溶液也应装入棕色瓶里，存放在暗处，种子染色也需在暗处和弱光处进行­（三）四唑法测定程序­《国际种子检验规程》的规定：­1．试验样品 从充分混合的净种子中，随机数取100粒种子，4次重复如果是测定发芽试验末期休眠种子的生活力，则单用发芽试验末期所发现的休眠种子­2．染色前的种子准备 ­（1）种子的预湿 预湿方法有以下两种：­① 缓慢预湿 按发芽试验所用的方法， ­将种子放在纸上或纸间吸湿该法适用于那些直接浸在水中容易破裂和损伤的种子，以及已经劣变的种子或过分干燥的种子­② 水浸预湿 将种子完全浸在水中，让其达到充分吸胀。

如果浸渍时间超过24h，则应换水部分植物种子在20℃下的预湿方式和最少预湿时间见表4-1、表4-2 ­（2）染色前的种子处理 ­许多植物的种类，在染色前需将其胚的主要构 造和活的组织暴露出来，以利于四唑溶液的渗 透，便于正确鉴定­①刺穿 对经过预湿的种子或硬实，可利用解剖针或解剖刀，刺穿种子的非主要部位­②纵切 所有禾谷类和禾本科牧草种子，像羊茅属大小种子或较大的种子，通过胚中轴的中 部纵向切开，约达胚乳长度的3/4；无胚乳而具有直立胚的双子叶植物种子，通过子叶略离 中轴的一半纵切，而不伤及胚中轴部分；胚被 活的组织包围着的种子，可沿着胚的旁边进行 纵切­③横切 用解剖刀、刀片通过种子非主要组织横向切断禾本科牧草种子：紧靠胚的上部横切，并将有胚的 一端浸入四唑溶液具有直立胚和无胚乳的双子叶植 物种子：从子叶末端部分横向切除1/3或2/5针叶树类种子：横向切去两端一小部分，以保证能打开胚腔 ，但不能伤及胚太重­④横剖 横剖可替代横切，是切开但不切断的一种处理方法适用于小粒禾本科牧草种子（如翦股颖属、梯 牧草属和早熟禾属）­⑤胚分离 胚分离可用于大麦、黑麦和小麦 ­⑥剥去种皮 具有坚硬被覆物的种子，如坚果和核果等，可将种子或预湿后的种子劈开或敲裂，但要注意避 免胚部受伤。

1.禾谷类和禾本科牧草种子通过胚和约在胚乳3/4处纵切 2.燕麦属和禾本科 牧草种子靠近胚部横切 3.禾本科牧草种子通过胚乳末端部分横切和纵切 4. 禾本科牧草种子刺穿胚乳 5.通过子叶末端一半横切，如莴苣属和菊科中的 其他属 6.纵切面表明像5进行纵切时的解剖刀部位 7.沿胚的旁边（伞形科 中的种和其他具有直立胚的种） 8.针叶树种子沿胚旁边纵切 9.在两端 横切，打开胚腔，并切去小部分胚乳（配子体组织）­3．四唑染色 ­染色时间因种子种类、样品准备方法、本身 生活力的强弱、四唑溶液浓度、pH和温度等因素的不同而有差异其中温度的影响最大 ，在20~45℃范围内，温度每增加5℃-10 ℃ ，其染色时间可减少一半部分植物种子在 30℃下的染色时间见表4-1、表4-2种子染色结束后，倾去溶液，用清水漂洗准备鉴定 规定的最适宜染色时间不是绝对的，可能 随着种子条件而发生变化­4．鉴定前处理 ­将已染色的种子样品，进行适当的处理，使胚的主要构造和活的 营养组织更加明显地暴露出来，以便观察鉴定­（1）直接观察 适用于染色前已进行样品准备的整个胚、摘出的胚中轴、纵切或横切的胚等样品。

­（2）轻压出胚 适用于样品准备时仅切去种子的一部分，胚的大部分仍留在营养组织内的样品在鉴定前用解剖针在种子上轻压 ，使胚向切口滑出­（3）沿胚中轴纵切 适用于样品未经准备的种子，如有些豆类种子­（4）剥去半透明的种皮或种子组织 适用于样品未加准备或仅切去基部的种子如大豆、豌豆等种子­（5）乳酸苯酚透明液的应用 适用于小粒种子，染色后加入2~4 滴乳酸苯酚透明液，移入38℃恒温箱保持30~60 min，经清水漂洗或直接观察­5．观察鉴定 ­一般鉴定原则是，凡是胚的主要构造及有关活营 养组织染成有光泽的鲜红色，为有生活力种子 禾本科：观察盾片、胚芽、胚轴、胚根；双子叶：观察子叶、胚芽、胚轴、胚根­凡是胚的主要构造局部不染色或染成异常的颜色，并且活的营养组织不染色部分超过允许范围， 以及组织软化的，为不正常种子­凡是完全不染色或染成无光泽的淡红色或灰白色 ，且组织已软腐或异常、虫蛀、损伤、腐烂的为 死种子不正常种子和死种子均作为无生活力种 子­鉴定时注意判断种子预措时胚部切偏和切面粗糙 对观测结果的影响麦类： a．盾片上下任一端三分之一不染色 b．胚根大部分不染色体，但不定根原始体必须染色 （谷子、高粱、水稻胚根 顶端三分之二不染色）。

a．胚根顶端不染色，花生为三分之一，蚕豆为三分之二，其他种为二分之一 b．子叶顶端不染色，花生为四分之一，蚕豆为三分之一，其他为二分之一 c．除蚕豆外，胚芽顶部不染色四分之一 ­瓜类：a．胚根顶端不染色二分之一b．子叶顶端不染色二分之一­棉花：a．胚根顶端三分之一不染色b．子叶表面有小范围的坏死或子叶顶端三分之一不染色 ­6．结果计算及处理 ­在测定一个样品时，应统计各个重复中有生活力的种子数，并计算其平均值重复 间最大容许差距不得超过表4-3的规定，平均百分率修约至最近似的整数­测定结果按规定格式填报对豆科的一些 种需增填测定中发现的硬实百分率，硬实 百分率应包括在所填报的有生活力的百分 率中平均生活力百 分率（%）最大容 许许范围围平均生活力百分 率（%）最大容 许许范围围123123992587~8813~1413983684~8615~1714974781~8318~2015965878~8021~2316956973~7724~281793~947~81067~7229~341891~929~101156~6635~451989~9011~1 21251~5546~5020­不同标准中四唑测定的一些差别­ GB/T3543.7-1995农作物种子检验规程对主要农作物及蔬菜种子生活力的四唑染色 技术作了 详细规定，其中对试验样品数量的规定是至少测 定200粒种子，即可以用200 粒、300粒、400粒 。

这与ISTA规程规定用100粒4次重复和AOSA《 四唑测定手册》认为可以用200粒，均有所不同­GB/T3543.7-1995规定四唑测定时，种子预湿温 度为30℃或20~30℃，四唑溶液浓度在 0.1%~1.0%，染色温度为35℃而ISTA规程中 ，预湿温度为20℃，四唑溶液浓度大多数种子采用1.0%，少数为0.5%，染色温度为30℃­三、离体胚测定法­（一）概述­自1904年Hänning.E 成功的培养了胡萝卜和辣根菜的离体胚以来，离体胚组织培养已有百年的历史该技术在植物育种中主要用于解决远缘杂种败育、种子休眠期过长以及 快速繁殖等问题Tukey1944年研究桃种子发现，未通过后熟种子和已通过后熟种子的胚在离体培养下生长速率一致，因此，认为胚胎培养法可用于快速测定这类种子的生活力目前，离体胚培养法已被广泛应用于木本植物种子的生活力测定­ 1．适用范围 1996版《国际种子检验规程》规定，离体胚测定只适用于下列已规定具体方法的植物种：­（1）槭属（Acer spp.）[复叶槭（A.negundo）和鸡爪槭（ A.palmatum）除外]；（2）卫矛属（Euonymus spp.）；（3） 属（Fraxinus spp.）；（4）苹果属（Malus spp.）和梨属（Pyrus spp.）；（5）加州山松（Pinus monticola）、扫帚松（ P.Peuce）和北美乔松（P.strobus）；（6）瑞士石松（ P.cembra）、大果松（P.coulteri）、巴尔干松（P.heldreichii ）、黑材松（P.jeffreyi）、红松（P.koraiensis）和日本五针松 （P.parviflora）；（7）李属（Prunus spp.）：欧洲甜樱桃（ P.avium）、比西氏樱桃（P.bessey）、黄果酸樱桃（ P.mahaleb）、稠李（P.padus）、柳栎野黑樱（P.serotina） 、美国稠李（P.virginiana）、杏（P.armeniaca）、桃（ P.persica）等；（8）花楸属（Sorbus spp.）；（9）椴属（ Tilia spp.）。

对于原先已发过芽的种子和发过芽又失水干燥的种子，不适合采用此法­2.原理 ­将离体胚在规定的条件下培养5～14 d有生活力的胚仍然保持坚硬新鲜的状态，或者吸水膨胀、子叶展开转绿，或者胚根 和侧根伸长、长出上胚轴和第一叶；而无 生活力的胚，则呈现腐烂的症状­（二）离体胚测定方法­1．试验样品 需用400粒种子设定重复次数（如4×100或 8×50）­2．浸种前处理 一些果实外部的坚硬果皮需去除­3．清水浸种 按种子吸。