琯溪蜜柚CmPME1的克隆及其在果实发育过程中的表达分析.docx

琯溪蜜柚CmPME1的克隆及其在果实发育过程中的表达分析 刘志发 潘腾飞 潘东明摘 要 利用RT-PCR技術从‘琯溪蜜柚中克隆得到1条PME（pectinmethylesterase）基因的ORF序列，命名为CmPME1该序列编码一个含有582个氨基酸的蛋白质，分子量63.37 ku，该蛋白属于稳定的碱性亲水性蛋白同源性分析表明：其编码的氨基酸序列与可可树（Theobroma cacao）、毛果杨（Populus trichocarpa）的同源性分别为76%、74%，与甜橙的氨基酸序列同源性高达99%实时荧光定量PCR结果表明，随着果实的发育，CmPME1的表达量逐渐升高，在花后170 d达到最高，然后逐渐降低，远中柱汁胞CmPME1的表达量高于近中柱关键词 琯溪蜜柚；PME；克隆；实时荧光定量PCRS813.3 A琯溪蜜柚[Citrus maxima（Burm.） Merr.]果实存在汁胞粒化的生理病害， 表现为汁胞中柱和轴端汁胞异常膨大， 汁胞变硬、细胞壁加厚、木质纤维化、出汁率下降， 风味变淡琯溪蜜柚果实汁胞粒化通常从囊瓣近蒂端汁胞发生， 后渐向果心发展， 其中以果心处长形汁胞粒化最为严重[1-3]。

据观察，琯溪蜜柚果实汁胞粒化发生在果实生长后期（一般为9月中下旬开始），采后贮藏期间果实汁胞粒化进一步加重[2]有报道指出果胶甲酯酶与柑橘果实的粒化有关[4-5]果胶甲酯酶（pectinmethylesterase，简称PME、PE， EC： 3. 1. 1. 11）广泛存在于植物以及一些细胞壁降解的微生物中[6]果胶甲酯酶能水解果胶生成果胶酸、甲醇、氢离子，进而导致果胶酸钙的形成[7-9]PME属于多基因家族，由于PME结构和表达模式的多样性，其作用也存在差异[10-11]植物中果胶甲酯酶在细胞壁降解[12-13]，小孢子发生和花粉管发育[14-16]，种子萌发[17]，根尖延伸[18]，果实的软化成熟[19]等方面起着重要作用近几年来，在植物中有关PME基因的克隆与表达已有许多报道，已从草莓、烟草、白菜等植物中克隆得到果胶甲酯酶基因[20-22]，认为该基因与果实衰老过程中结构变化、植物病毒之间存在相互作用、雄性不育等功能有关此外，在柑橘汁胞和柑橘皮中也克隆得到了PME基因[23-24]为从探明‘琯溪蜜柚CmPME1在果实生长过程中表达水平变化与果实粒化的关系，本研究利用RT-PCR技术从‘琯溪蜜柚汁胞中克隆得到CmPME1的ORF序列，并对其进行了生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR技术检测‘琯溪蜜柚果实发育不同时期和不同部位的CmPME1的表达特性。

1 材料与方法1.1 材料本实验所用材料采自漳州市平和县小溪镇果园采集时间为2013年7月16日至10月28日，约每隔10 d采集1次样品取汁胞冻于液氮中，存放于-80 ℃1.2 方法1.2.1 总RNA的提取、检测及cDNA第一链的合成柚汁胞总RNA提取参照钟凤林等[25]的Trizol方法提取，紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度按照Trans ScriptⅡFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒合成cDNA第一条链1.2.2 CmPME1基因ORF的克隆 采用Primer 5.0软件设计引物根据甜橙基因组中PME中的cDNA序列，在起始密码子和终止密码子位置设计引物（见表1），引物合成与测序均委托上海博尚生物技术有限公司完成以琯溪蜜柚汁胞cDNA为模板，进行PCR扩增反应体系为25 μL，其中10Ex-TaqBuffer 2.5 μL，dNTPs（10 mmol）0.5 μL，上下游引物（10 μmol）各0.5 μL，模板cDNA1 μL，Ex-Taq（5 U/μL）0.15 μL，加水至终体积25 μL反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，35个循环；最后72 ℃再延伸10 min。

PCR反应结束后电泳检测，将目的片段回收、连接、转化、测序1.2.3 CmPME1的荧光定量表达 实时荧光定量PCR引物的设计与合成：以‘琯溪蜜柚Tubulin基因为内参基因，根据已克隆的CmPME1基因的ORF序列，按照标准荧光定量PCR引物原则设计引物（表2）用试剂盒的方法分别提取‘琯溪蜜柚果实发育不同时期和不同部位汁胞的总RNA，每个样品进行3次生物重复，并以它们为模板，按照PrimeScript RT reagent kit（Perfect Real Time）试剂盒的方法合成cDNA第一链，-20 ℃保存备用荧光定量PCR在罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪上进行将合成的cDNA（500 ng/μL）稀释10倍作为模板，进行荧光定量PCR反应体系为20 μL：2SYBR PremixEx TaqⅡ10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至终体积20 μL，每个样品进行3次技术重复PCR反应程序采用两步法：95 ℃ 30 s（预变性过程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环（PCR反应过程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min（熔解曲线分析过程）。

根据荧光定量PCR目的基因CmPME1和内参基因β-Tubulin的Ct值，利用2-ΔΔCT（Livak）方法对果实发育不同时期和不同部位汁胞的CmPME1基因进行相对定量计算1.2.4 序列分析与生物信息学分析 采用ExPASy ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）进行蛋白质理化性质的分析；采用Tmpered（http：//www.ch.embnet.org/software/tepred-form.html）进行跨膜结构预测与分析；采用PSORT（http：//psort.nibb.ac.jp/）进行亚细胞定位预测与分析；利用Mega 5.22进行系统进化树分析2 結果与分析2.1 CmPME1 ORF序列的获得与CmPME1系统进化分析CmPME1所扩增的ORF片段大小为1 748 bp（图1），经DNAMAN软件分析CmPME1编码582个氨基酸，ATG为起始密码子，TAA为终止密码子（图2）经Blast比对发现，该氨基酸序列与陆地棉（Gossypium hirsutum）、可可树（Theobroma cacao）、毛果杨（Populus trichocarpa）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的氨基酸序列的同源性分别达77%、76%、74%和71%，与甜橙（Citrus sinensis）的氨基酸序列同源性为99%。

利用Mega 5.22近邻相接法（Neighbor-Joining，NJ）对CmPME1与来自12种不同物种的PME蛋白进行系统进化分析（图3）从图3可以看出，12种不同植物的PME蛋白聚成一类，CmPME1和同属于柑橘属的甜橙的PME蛋白亲缘关系最近2.2 CmPME1编码蛋白理化性质和亚细胞定位预测分析通过ProtParam软件对CmPME1蛋白进行基本的理化分析可知，相对分子量为63.37 ku，分子式为C2 784H4 428N796O851S22该蛋白由20种氨基酸残基组成，其中丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）的含量较丰富，比例分别为9.8%、8.2%、7.9%；该蛋白含54个带负电的氨基酸（Asp+Glu）和66个带正电的氨基酸（Arg+Lys）， 总平均疏水指数-0.251，其理论等电点为9.16，不稳定指数为29.74，说明该蛋白属于稳定的碱性亲水性蛋白利用程序wolf psort分别对‘琯溪蜜柚CmPME1蛋白的亚细胞定位进行分析，CmPME1蛋白粒体内膜的分值最高，推测该蛋白定位粒体内膜2.3 CmPME1在果实发育不同时期和不同部位的表达CmPME1在果实发育不同时期和不同部位的荧光定量表达如图4。

从图中可以看出，随着时间的增加，CmPME1的表达量呈现先逐渐升高后逐渐降低趋势，在花后170 d表达量达到最高，远中柱汁胞CmPME1的表达量高于近中柱3 讨论与结论目前，PME已经在很多植物中被克隆和研究，但在柚中未见报道本研究克隆得到1条PME的ORF序列系统进化树分析结果表明，CmPME1与其它植物的PME有较高的同源性CmPME1氨基酸序列与甜橙亲缘关系最近，同源性高达99%大部分种类的果实中PME活性都随果实的成熟程度增强，使果胶、纤维素等细胞壁物质发生降解，从而导致果肉的软化[26-27]荧光定量PCR结果表明，‘琯溪蜜柚果实的成熟过程中，CmPME1的表达量逐渐升高可能与果实成熟过程中，果实变软有关‘琯溪蜜柚果实汁胞粒化发生在果实生长后期，本研究CmPME1在花后170 d表达量最高，远中柱汁胞CmPME1的表达量高于近中柱可能是由于柚果实汁胞在花后170 d左右开始发生粒化，粒化过程中CmPME1基因的表达量逐渐降低Singh等[28]报道，粒化与果胶甲酯酶的活性呈负相关，粒化程度高的Kaula宽皮柑橘的果胶甲脂酶活性最低而‘琯溪蜜柚果实汁胞粒化通常从囊瓣近蒂端汁胞发生，后渐向果心发展。

Chakrawar等[29]也报道粒化果实的果胶甲酯酶活性比正常的低，并认为果胶甲酯酶与粒化有关可见，近中柱CmPME1的表达量较远中柱低，可能是因为近中柱最易发生粒化，表达量较低佘文琴等[30]研究了‘琯溪蜜柚果实发育过程中PME酶活性，发现其活性在9月28日达到最高，之后下降，这与CmPME1的表达量的变化趋势有一定相似性但是否因粒化导致CmPME1的表达量下降还待进一步研究参考文献[1] Daulta B S， Arora R K. Studies on granulation in different cultivars of sweet orange（C. sinensis Osbeck）[J]. Haryana Journal of Horticultural Sciences， 1990， 19（1-2）： 18-21.[2] 潘东明， 郑国华， 陈桂信， 等. 琯溪蜜柚汁胞粒化原因分析[J]. 果树学报， 1999， 16（3）： 202-209.[3] 张振珏， 谢志南， 许文宝. 琯溪蜜柚汁囊分化和粒化过程的解剖学观察[J]. 植物学报， 1999， 41（6）： 16-19.[4] Chakrawar V R， Singh R J. Studies on citrus granulation II Physiological and biochemical aspects of granulation[J]. Haryana J Hort Sci， 1977， 6（3/4）： 132-135.[5] Prasanna V， Prabha T N， Tharanathan R N. Fruit ripening phenomena-an overview[J]. Critical reviews in food science and nutrition， 2007， 47（1）： 1-19.[6] Ly-Nguyen B， Van Loey A M， Fachin D， et al. Partial purification， characterization， and thermal and high-pressure inactivation of pectin methylesterase from carrots（Daucus carrota L.）。