溶解曲线问题.pdf

问题：融解曲线前端不太正常1：融解曲线形成原理融解曲线是不断升温至95℃过程中采集的荧光值也就是说在不同温度条件下， DNA 进行解链，荧光染料从双链中游离出来，从而出现荧光值的降低但是当温度达到DNA 解链一半的温度时，也就是Tm值时，荧光染料会大量游离出来，从而使荧光值迅速降低，最后转换成导数后形成高峰利用荧光染料可以指示双链DNA 熔点的性质， 通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而区分非特异性扩增图一：纵坐标为将荧光强度的变化对温度的变化求导dI/dT) （融解曲线呈单一峰时，表示无非特异性产物，荧光定量准确）2：融解曲线的两种不同形式图二对图二曲线每一个位置求导，负导数（-dI/dT ）作为纵坐标，得到图三：图三3：红色框位置曲线解释图四融解曲线的采集过程中，温度的变化为每0.05s 上升 0.3℃，buffer成分（Tris-HCl）随着温度的上升， pH 降低，导致 SYBR Green 的荧光信号强度降低因此在 68℃-75 ℃度之间，虽然没有DNA 双链解开，但是荧光信号发生降低温度在 65℃-68 ℃之间（红色框框位置），虽然温度逐渐上升，但是荧光信号强度不变，可能的原因是：（1）虽然温度上升， pH 值降低，但是如果pH 值依旧在 SYBR Green 完全发光的范围内，则荧光信号不发生变化。

2）起始荧光信号过强，荧光信号在一定范围内的减弱不能被仪器检测到，因此显示的荧光信号不发生变化4：AceQ 融解曲线问题 -- 为什么有时候在融解曲线的前端出现凹下去的曲线以 stepone one为例：图五AceQ 促解链成分相对较多，抑制退火延伸；因此在退火延伸阶段（60 度，1min ）存在部分链退火不充分；因此在信号刚开始采集阶段，部分链会继续退火形成双链， 荧光信号增强， 退火充分后荧光信号达到最大值，此后随着温度的上升，pH 降低，导致 SYBR Green 的荧光信号强度降低， 反映在融解曲线图六中为红色框所示。