虎杖中虎杖苷的微生物发酵转化研究.doc

虎杖中虎杖苷的微生物发酵转化研究摘 要:从中药材虎杖中筛选到一株具有转化虎杖苷能力的根霉菌株 T-34,利用该菌株产生的 B-葡萄糖苷酶能将虎杖苷转化为白藜芦醇.虎杖的液体发酵动力学研究结果显示:根霉菌T-34 能够直接利用虎杖煮提液中的碳源、氮源等作为其生长所需的营养,并且产生的 B-葡萄糖苷酶与底物虎杖苷的转化具有相对应的关系,用 HPLC 测得虎杖苷的转化率达 98%.关键词:微生物转化;虎杖;虎杖苷;白藜芦醇;B-葡萄糖苷酶Biotransformation of polydatin fromPolygonum cuspidatumbyRhizopussp. T-34Abstract:Rhizopussp.T-34, isolated by strain-screening test, could transform polydatin into resveratrolduring fermentation ofPolygonum cuspidatumin this experiment. Kinetics of fermentation was studied tofollow the transformation process, and the results suggested thatRhizopussp.T-34 could utilize carbon re-source, nitrogen resource and etc directly as its nutrition, furthermore,B-glucosidase produced by the strainwas correspondingly related to the transformation of polydatin, and the transformation rate of polydatin couldreach 98%.Key words:microbial transformation,Polygonum cuspidatum,polydatin, resveratrol,B-glucosidase1 引 言虎杖始载于 5 名医别录 6,为蓼科植物虎杖的干燥根茎,主要有效成分为二苯乙烯类和蒽醌类化合物,前者包括白藜芦醇及其糖苷[1].据报道白藜芦醇具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗过敏、抗动脉粥样硬化和具有冠心病、缺血性心脏病、高血脂症的防治作用,白藜芦醇已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一[2].干燥虎杖根茎中白藜芦醇含量仅为 0.1%~0.2% ,而虎杖苷含量约为 2%左右[3],虎杖苷可在肠道中被糖苷酶分解释放出白藜芦醇,发挥其药理作用[4].目前有研究用酸水解法对虎杖苷进行分解[5],但是酸碱会造成环境污染,降低产量,因此不宜用化学法进行水解.也有用改性纤维素酶直接对虎杖苷进行分解[6],但成本较高、工艺较为复杂,不利于推广应用.本项研究采用微生物发酵法转化虎杖苷,即没有强烈的酸碱反应发生,又无需粗提苷,有效的避免了上述两种方法存在的缺陷.因此利用专一微生物进行发酵是提高虎杖中白藜芦醇含量的有效2008 年 4 月 第 45 卷第 2 期 四川大学学报(自然科学版)Journal of Sichuan University (Natural Science Edition)Apr. 2008Vol.45 No.2 途径之一.2 材料和方法2.1 材 料2.1.1 仪器和试剂 虎杖购于成都同仁堂药房,并经成都中医药大学药用植物鉴定室鉴定为蓼科植物虎杖的根茎.白藜芦醇标准品(购于成都思科华有限责任公司),高效液相色谱仪(美国 Waters公司),Tu-1800 紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),GBRT 全自控 10L 发酵罐(烟台高新区海洋生物工程研究所).2.1.2 培养基 初筛平板:主要成分为 0.2%NaNO3, 0. 1% K2HPO4, 0. 05% KCl, 0. 05%MgSO4, 0.01% FeSO4, 1%虎杖苷.发酵培养基(复筛培养基):主要成分为虎杖煮提液.2.2 方 法2.2.1 菌种的筛选 取自然长菌的虎杖粉 1 g,加入 20 mL 的无菌水,摇匀,静置片刻,取上清液 0.5mL 梯度稀释,各吸取 0.2 mL 于初筛平板上按常规涂布方法 30e 培养 3~4 d,挑选长势良好的单菌落,得到青霉,黄曲霉,木霉,根霉等四十株菌种,保藏待用.将初筛菌种接入复筛培养基中,32e,170 r/min 摇床中发酵 3 d.TLC 和 HPLC 法检测发酵产物.2.2.2 TLC 检测法 见文献[7] .2.2.3 HPLC 检测法 高效液相色谱仪测定白藜芦醇和虎杖苷的色谱分析条件:色谱柱 C18 柱(416@150 mm);柱温 25e;流动相是甲醇:水为40B60;流速 1 mL/min,进样量 20LL;检测波长305 nm.根据标准样的峰面积和进样浓度作回归曲线,白藜芦醇的回归方程为 y=1.40@108x+1121@104,相关系数 R=0.9999,在 20@10-6g/mL~100@10-6g/mL 范围内和峰面积成线性关系;虎杖苷的回归方程为 y= 9.61@107x-1.84@105,相关系数 R=0.9998,在 20@10-6g/mL~100@10-6g/mL 范围内和峰面积成线性关系.2.2.4 发酵动力学研究 采用 GBRT 全自控发酵罐 10 L 进行发酵罐培养,发酵罐装培养液量为8 L,接种量为 5%,孢子悬液浓度为(1.00?0.05)@108cfu/mL,发酵温度为 32e,转速为 300 r/min,通气量为 0.06 m3/h,初始 pH 为 4.6,发酵周期 132 h.发酵动力学的研究内容包括了菌体生长量,碳源,氮源,酶活,pH,苷和苷元变化.菌体生长量的测定方法采取细胞干重法;多糖的测定方法用苯酚硫酸法进行测定;还原糖的测定法是用 DNS法进行测定;总蛋白的测定方法是凯氏定氮法;用PNPG 作底物进行 B-葡萄糖苷酶酶活的测定[8];溶氧采用 GBPT 全自控发酵罐溶氧测定仪测定;发酵罐检测 pH 值;苷和苷元的检测方法如21213 所述.3 结果与分析3.1 菌种的筛选将初筛保存的 40 株菌种分别接种虎杖煮提液(复筛培养基),32e,170 r/min 摇床中发酵 3 d,发酵液作产物 TLC 检测,结果如下.表 1 转化虎杖苷的菌种筛选Tab.1 Screen microorganisms for biotransformationof polydatin菌种虎杖苷白藜芦醇空白对照 CK + -青霉 Penicillium chrysogenum+ +黄曲霉 Aspergillus flavus+ -黑曲霉 Aspergillus niger+ +木霉 Trichodermasp - -根霉 T-7Rhizopussp T-7 + -根霉 T-13Rhizopussp T-13 + +根霉 T-16Rhizopussp T-16 + +根霉 T-26Rhizopussp T-26 + +根霉 T-34Rhizopussp T-34 - +根霉 T-38Rhizopussp T-38 + ++: TLC 上检测到明显的物质;-: TLC 上未检测到明显的物质由表 1 结果可以看出,其中根霉 T-34 菌种的虎杖发酵液的 TLC 结果表明虎杖苷斑点完全消失,白藜芦醇斑点加深明显,此菌株即为目标菌株,该菌株与虎杖共发酵能成功将虎杖苷转化为白藜芦醇.3.2 发酵产物的 HPLC 检测在 3.1 所述发酵条件下进行液体发酵,并采用HPLC 法对发酵转化产物进一步检测.图 1 为虎杖苷转化产物的 HPLC 检测结果.对比色谱图 Ñ,Ò,可以看出保留时间 4.807 min 虎杖苷的吸收峰完全消失,保留时间 14.870 min 白藜芦醇的吸收峰增加明显,这充分证明了该根霉菌与虎杖的共发酵达到了完全转化虎杖苷的目的,生成了目标物白藜芦醇.438 四川大学学报(自然科学版)第 45 卷图 1 虎杖苷转化产物的 HPLC 分析Fig.1 HPLC analysis of transformation product of PolydatinÑ 发酵前的虎杖提取液(10 g/L);Ò 发酵后的虎杖提取液(10 g/L )3.3 发酵动力学的研究在 2.2.4 的发酵罐培养条件下进行发酵,每隔一段时间取样,研究发酵过程中菌体量、总糖(多糖和还原糖)、总蛋白、苷和苷元、酶活、溶解氧、pH 的变化.进一步揭示了根霉 T-34 转化虎杖苷的发酵机理,也为该菌种的实际应用提供了参考数据:产物白藜芦醇的积累与酶活密切相关,与菌体生长直接偶联;菌体生长过程中消耗了大量的碳氮源,36h 菌体生长进入稳定期,虎杖苷转化为白藜芦醇也在 36 h 基本完成.这预示着生产过程中若要连续培养,36 h 是最佳的补料时间.3.3.1 菌体的生长动力学 由图 2 可知:在整个发酵周期中,碳氮比例变化范围为 2.3~1.7,此碳氮比例能满足根霉菌种的生长.在 36 h 前,总糖(还原糖和多糖)和总蛋白都迅速降低,为菌体的大量生成提供丰富的碳源和氮源.36 h 后随着菌体量达到最大,碳源和氮源的消耗速度大幅度的减缓;其中还原糖有缓慢增加的趋势,可能的原因是稳定期中微生物产生了多种酶类如糖化酶、纤维素酶等,这些酶水解淀粉、纤维素等又产生了少量还原糖.3.3.2 菌体量、pH 和溶解氧的动力学曲线 由图3 可知:发酵过程中随着菌体量的增加,溶液的 pH由 4.6 下降到 4.2,可能的原因是根霉菌生长能够利用碳源产生了少量有机酸;36 h 以后 pH 变化趋于平缓,92 h 后又有所下降;发酵过程中,溶解氧由 100%下降到 80%,是由于发酵罐中高速的搅拌速度和较高的通风量使溶氧量维持在较高水平.图 2 菌体量,还原糖,多糖以及总蛋白的动力学曲线Fig.2 Kinetic curves of biomass, reducing sugar,amylase and total protein3.3.3 酶和底物、产物的动力学曲线 由图 4 可知:24 h 前虎杖苷和白藜芦醇的变化不明显,24~36 h,由于 B-葡萄糖苷酶的水解作用,虎杖苷由0153 g/L 迅速降低直至转化完全,白藜芦醇由0104 g/L 迅速增加到最大量 0.332 g/L,36 h 以后白藜芦醇的量逐步减少.从酶活曲线可见,B-葡萄糖苷酶酶活从 12 h 开始增加,36 h 酶活基本达最大值 2.68 U/mL,36 h 后酶活缓慢降低.由此可见酶活的变化趋势和底物虎杖苷的转化是相对应的.另外要指出的是白藜芦醇的分子量 228,虎杖苷分子量 408,根据该图中虎杖苷的最大量和白藜芦醇的增加量计算出虎杖苷转化为白藜芦醇的转化率可达 98%.439 第 2 期田天丽等:虎杖中虎杖苷的微生物发酵转化研究 图 3 菌体量、pH 和溶解氧的动力学曲线Fig.3 Kinetic curves of biomass, pH valueand dissolved oxygen图 4 虎杖苷,白藜芦醇以及 B-葡萄糖苷酶酶活的动力学曲线Fig.4 Kinetic curves of polydatin , resveratrol,andB-glucosidase activity4 讨 论微生物有着非常强大的分解转化物质的能力,并能产生丰富的酶系,这些丰富而强大的酶系就可能成为中药化学成分在较温和的条件下催化化学反应的物质基础,也就是微生物可以用来发酵转化中药的理论根据[9].本文在此理论基础上对中药虎杖进行微生物的发酵转化,培养基直接采用中药虎杖,不需添加其他成分,发酵条件易控制,且虎杖苷成分转化效率高.通过微生物发酵转化虎杖,一方面提高虎杖中苷元含量。