非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类.docx

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Nat ive-PAGE)的分类有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法： blue native (BN-PAGE)， clear native(CN-PAGE), quantitative preparative native continuous (QPNC-PAGE)在一个典型的native PAGE方法中，复合物被 CN-PAGE或BN-PAGE分离然后可以用其它分离 方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离随 后切割凝胶，蛋白复合物每一个部分都被分开 蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或 重新测序这样就可以提供一个蛋白复合物中单 个蛋白的重要信息1. Blue Native PAGEBlue Native PAGE 是最古老的 Native-PAGE 技 术是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定 染料的一种电泳方法这种方法的缺点是：考马 斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能 导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基 的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用 Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作 用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离=1范围在 100KDa-10MDa。

在 Blue native PAGE过 程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增 溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮 蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在 pH7.5条件下也会向阴极迁移但是，蛋白质虽 然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还 是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减 小,蛋白质最终迁移到其自身大小与凝胶孔径相 近似的位置而停止并且在分离膜蛋白的过程 中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与 酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水 性，溶解性大大提高1.2 Clear Native PAGEClear Nat ive PAGE 是通过除染色以的其它方法 如SLS鉴定蛋白的电泳技术然而，这种方法最 大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用，特 别是和质谱联用Clear Nat ive PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶中分离 酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI<7 ）的电泳技术， 分辨率通常比BN-PAGE低迁移距离决定于蛋白 的固有电荷和凝胶孔径大小因此，BN-PAGE比 CN-PAGE应用更广泛然而CN-PAGE在考马斯染料分析天然混合物干扰进一步分析时存在着优 势。

如测定催化活性（例如线粒体ATP合酶）或 分离用于荧光共振能量分析的微量膜蛋白，CN-PAGE比BN-PAGE更温和，特别是使用洋地黄 皂苷时，CN-PAGE可以保持膜蛋白的超分子组合 体的结构而BN-PAGE会导致分解线粒体ATP合 酶中的具有酶活性的低聚物可以用CN-PAGE检 出，但BN-PAGE无法检出CN-PAGE起源于无色非变性PAGE，是BN- PAGE 之后出现的技术既然CN-PAGE中没有带电荷的 染料，蛋白在电场中的迁移完全取决于这个蛋白 的固有电荷大分子和低聚蛋白必须有合适的物 理参数才能在CN-PAGE中分开，特别是PI低于 5.4,分辨率低由此看来，CN-PAGE除了获得 未染色的蛋白以外在分析膜蛋白中没有什么优 势了优点是条件更温和，在蛋白质组学研究中 具有更大优势BN-PAGE和CN-PAGE的缓冲液和 电泳条件一致，但是CN-PAGE的阴极缓冲液中不 含考马斯染料，而是将0・025%的洋地黄皂苷加 入到凝胶中1.3 QPNC-PAGEQPNC-PAGE (quantitative preparative nativecontinuous polyacrylamide gelelectrophoresis）是一种应用于生物化学和生 术。

这种凝胶电泳被生物学家应用于独立活性或 天然金属蛋白样品或正确或非正确折叠的可溶 性的与金属辅助因子结合的蛋白混合物的鉴定1.3.1电泳缓冲液QPNC-PAGE是在特殊的装置里进行的分离生物活 性分子的电泳过程在特殊的电泳缓冲系统(基 于Tris-HCl和NaN3)中，一个生物系统中的大 多数蛋白都会带电荷，在电场的正负极之间迁 移尽管PH (10.00)的电泳缓冲液并不与细胞或组 织中的生理PH相符，但是在生理PH (8.00)的 缓冲体系下蛋白会连续洗脱并分成不同的部分 分离系统包括电泳槽和分部收集器，这些装置要 置于冰箱中1.3.2凝胶特征为了得到一个PAGE所需的聚合完全的凝胶，聚 丙烯酰胺凝胶需要在室温下凝聚69hr最后， 得到均质的含机械稳定和自由的单体或原子凝 胶的孔径很大，因此分子筛作用在电泳分离中最 小化基于上述原因，凝胶和活性分子之间的相 互作用可以忽略待分离的金属蛋白（如金属分 子伴侣，蛋白酶感染性初级因子，金属运输蛋白， 淀粉状蛋白，金属酶，金属肽等）不会分解成脱 辅蛋白和金属辅助因子孤立蛋白的生物活性结 构（天然或3D构象）在QPNC-PAGE后不会发生 构象变化。

所以，金属蛋白和蛋白异构体在PAGE 中被定量的分成高纯度的部分QPNC与其它电 泳技术如SDS-PAGE，2-DE，等速电泳和CN- PAGE 等相比被称为“突破性的方法”1・3・3实验方法（1）储备液1) 200mM Tris—HCl 10mM NaN3 PH10・00，室温2） 200mM Tris—HCl 10mM NaN3 PH8.00，室温3） 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C，4°C （新鲜）（2） 电泳缓冲液20mM Tris—HCl 1mMNaN3 PH10・00 （除气），4C电泳槽上部：500ml电泳缓冲液电泳槽下部：2000ml电泳缓冲液（3） 洗脱液20mM Tris—HCl 1mMNaN3 PH8.00 （除气），4C 洗脱室：700ml洗脱缓冲液（4）分离胶丙烯酰胺4%T体积40ml成分：4ml40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C4ml 200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00 32 mL H2O200 uL 10% APS20 uL TEMEDAPS和TEMED最后加入轻轻搅拌烧瓶中的混合 物，注意不能产生气泡然后把溶液移入内径为 28mm,长为40mm有刻度的玻璃柱中。

加入3ml 正丙醇60分钟聚合后用电泳缓冲液冲洗凝胶, 然后用4ml电泳缓冲液覆盖凝胶表面在室温下 凝集69小时5）样品的准备和收集保持样品（生物液体）温度为4C0.3ml甘油 和2.7ml样品在分离前混合5分钟然后把处理 好的样品加入到电泳缓冲液的上层这些蛋白在 此电泳缓冲液中不是带负电（PI<10.0）就是带 负电（PI>10.0），因此在电场中不是从正极迁 移到负极就是从负极迁移到正极已分离的蛋白 分子用特殊的生理洗脱液连续洗脱，并用分部收 集器收集整个分离系统必须在4**C冰箱中进行 纯化的，半纯化的和未处理的样品都可以用于 QPNC样品分离纯化中应该避免类似于蛋白质沉 淀等过程以防止蛋白变性化学稳定的金属蛋白 可以用非变性的凝胶渗透层析来进行进一步纯 化1.3.4定量和鉴定Fe， Cu， Zn， Ni, Mo, Pd, Co, Mn, Pt,Cr, Cd和其它金属辅因子可以通过ICP-MS(Induetively coupled plasma mass spectroscopy,电感耦合等离子体质谱)来定性 和定量因为PAGE条带的高纯度和选择性凝集, 相关的结构可以用非变性条件下的NMR来分析。

1・3・5应用QPNC的应用对象为分子量6-200kDa的酸性、碱 性和中性金属蛋白在测定血液或其它临床样品 中独立的金属蛋白结构和功能关系方面具有重 要应用，因为不正确的金属陪伴蛋白的折叠例 如超氧化物歧化酶(SOD)的铜陪伴蛋白出现在 这些基质中或许预示着神经病变疾病如肌萎侧 索硬化病等QPNC-PAGE, SEC, ICP-MS 和 NMR 等技术的连用可以得到病人或潜在的病人液体基质中相关金属蛋白的生理状态的结构这一技 术可以提高蛋白错折叠相关疾病的诊断和治疗 水平。