1、基因工程,专题1,基因工程的产物,什么叫基因工程?,基因工程,又叫DNA重组技术。通俗的说,就是按照人们的意愿,把一种生物的某种基因提取出来,加以修饰改造,然后放到另一种生物的细胞里,定向地改造生物的遗传特性。,基因工程的概念,基因工程的概念,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,剪切, 拼接, 导入, 表达,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,达尔文提出生物进化论,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,摩尔根证明基因在染色体上,并提出基因的连锁互换定律。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,艾弗里证明DNA是遗传物质,DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制,基础理论和技术发展催生了基因工程,
2、科技探索之路,后期基础理论,克里克等提出中心法则,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码,1966年霍拉纳用实验加以证明。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,1)基因转移载体的发现 2)工具酶的发现 3)DNA合成和测序技术的发明 4) DNA体外重组的实现 5)重组DNA表达实验的成功 6)第一例转基因动物问世 7)PCR技术的发明,问题探讨:,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。 让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达,可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。 想一想需要做哪些关键工作?,普通棉花 抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程:,在以上过程中关键步骤或难点是什么?,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,通过运载体导入,转基因棉花含抗虫基因,转基因棉花产生伴胞晶体,转基因棉花有抗虫特性,1.1、DNA重组技术的基本工具,基因工程培育抗虫棉的关键步骤:,关键步骤一:,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二:,抗虫基因与棉花DNA“缝合”,关键步骤三:,抗虫基因进入棉花细
3、胞,1.1、DNA重组技术的基本工具,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具?,“分子手术刀” 限制性核酸内切酶,“分子缝合针” DNA连接酶,“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体,1.1、DNA重组技术的基本工具,思考:,自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况? 2.单细胞生物并没有在进化中灭绝,有何保护机制?,可能产生了一些特殊的酶来防范。可而这种酶能识别外来侵入的DNA并将其分解,而对自身的DNA不能起作用。,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,主要来源: 种类与命名: 作用特点(特异性) 4.限制酶识别序列 5.作用结果:,识别特定核苷酸序列,并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要从原核生物中分离纯化,产生黏性末端或平末端,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,思考与探究 P7 (2),为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA? 1、细菌中含有某种限制酶的细胞,其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列; 2:通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上,使限制酶不能将其切开。
4、,二、“分子缝合针” DNA连接酶,作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA,即将脱氧核糖和磷酸连接起来.,作用原理:,催化磷酸二酯键形成,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来,,Ecoli DNA连接酶 或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来,但效率较低,T4DNA连接酶,类型:,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复 磷酸 二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,寻根问底,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上,形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板,将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来,不需要模板,3、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗?,迄今为止,所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力,至于原因,现在还不清楚,也许将来会发现可以连接单链DNA的
5、酶。,思考与探究 P7,三、“分子运输车” 基因进入受体细胞的载体,载体需要的条件: 有1多个限制酶切点 对受体细胞无害 导入基因能在受体细胞中复制、表达 有某些标记基因,便于筛选 常用运载体: 细菌的质粒 噬菌体或某些动植物病毒,假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录,转基因生物能有预想的效果吗?,作为分子运输车载体,如果没有切割位点将会怎样?,霍乱菌的质粒多个限制酶切点,你会用它来做分子运输车吗?,目的基因有没有进入受体细胞,如何去发现?,常用的载体:质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在,可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,2、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗?为什么?,提示: 基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒(plasmid),即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。 是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢? 不是,作为基因工程使用的载体必需满足以下条件:,思考与探究 P7,1) 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点,以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶
6、的切点所处的位置,还必须是在质粒本身需要的基因片段之外,这样才不至于因目的基因的插入而失活。 2) 载体DNA必需具备自我复制的能力,或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 3) 载体DNA必需带有标记基因,以便重组后进行重组子的筛选。 4) 载体DNA必需是安全的,不会对受体细胞有害,或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 5) 载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件,都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,种类与命名:,现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。,EcoR,Sma,粘质沙雷氏杆菌 (Serratia marcesens),大肠杆菌 (Escherichia coli R),Go back,练习:流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶,则分别命名为:,Hind、Hind和Hind,T,磷酸二酯键,A,作用特点:,Go back,限制酶的识别序列:,Go back,能被限制
7、性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列:在切割部位,一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。,EcoR,黏性末端,黏性末端,作用结果,作用的结果:,EcoR,黏性末端,黏性末端,重复演示,什么叫黏性末端?,被限制酶切开的DNA两条单链的切口,带有几个伸出的核苷酸,它们之间正好互补配对,这样的切口叫黏性末端。,Sma,平末端 平末端,限制酶所识别的序列,无论是6个碱基还是4个碱基,都可以找到一条中轴线(如图),中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的。,想一想限制酶所识别的序列有什么特点?,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口?可产生几个黏性(平)末端?,要切两个切口,产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割,会怎样呢?,会产生相同的黏性(平)末端,然后让两者的黏性(平)末端黏合起来,就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,EcoR,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,不同来源的DNA片段混合,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,G AATTC CTTAA G,G AATTC CTTAA G,酶切,Go back,
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