双萤光素酶报告基因技术

1、双萤光素酶报告基因技术 的应用戴吉芮 博士戴吉芮 博士 技术服务代表技术服务代表 Promega 北京办事处北京办事处自然界的萤光自然界的萤光发光真菌发光真菌发光节虫发光节虫发光海星发光甲壳虫自然界的萤光发光鱼发光甲虫自然界的萤光萤火虫报告基因的作用 细胞信号转导途径 启动子/增强子 受体结合 病毒/细胞相互作用 转录因子 药物诱导作用或”效果”各种报告基因的优点和缺点报告基因优点萤光素酶优越的灵敏度 高信号值 无内源活性灵敏度好灵敏度好 植物中内源活性低分泌性报告基因 (不需裂 解)-真核细胞没有背景表达 -易于使用 -设备现成(液闪仪,层析)显微镜: 亚细胞定位 不需底物-galGUS（葡糖醛酸糖 苷酶）SEAP（分泌性碱 性磷酸酶）CAT（氯霉素转乙 酰基酶）GFP（绿色荧光蛋 白）缺点需要底物细菌，血清等内源活性高 需要底物 90% 的 E.coli, 人动物细胞中 有内源活性 酶的扩散可引起 “过度报告” 需要底物在 HeLa ,癌 和其它细胞类型 中有高的内源活性 需要底物放射性的 灵敏度底 50半衰期背景可能高 折叠 “情形” 可导致信号差别萤光素酶报告基因的主要优点 非

2、放射性。 检测快（比CAT等）。 灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍）。 半衰期短。（在理想条件下，可检测到10-20摩尔的 萤光素酶分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植 物细胞中半衰期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中的 半衰期约50小时）。 线形范围广。（在10-16M(10pg/L)至10-8M(1mg/L) 范围内,光强度与萤光素酶浓度成正比）。 一般比显微镜检测的荧光更灵敏 (对多孔板而言)。 生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光 子发射器。 通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力。萤光素酶报告基因的使用 原理: 制备含有 luc/ Rluc 的DNA 转染 提供刺激 测量萤光Luc调节序列在活细胞中做报告基因检测外界刺激(导引物)萤光素酶基因蛋白质折叠调节序列加工转录转录因子信号转导翻译反义 RNA受体蛋白-蛋白 相互作用RNA 酶病毒感染 和增殖RNAi 抑制启动子/增强子分析 “碰撞启动子”:1) 全序列:2) 逐步缺失:Promoterluc+LightPromoterluc+Lightluc+PromoterFirefly and Reni

3、lla萤火虫生物萤光的化学萤火虫生物萤光的化学萤光素酶萤光素酶Oxyluciferin + AMP + PPi+ CO2+ Light萤光素萤光素 + ATP + O2Mg2+萤光素酶萤光素酶:单体单体, 61,000 Daltons辅辅-底物底物:ATP. Mg2+萤光素萤光素:海肾萤光素酶反应海肾萤光素酶反应萤光素酶萤光素酶Coelenterazine + O2Coelenteramide + CO2+ Light萤光素酶萤光素酶: 单体单体, 36,000 Daltons萤光素萤光素:(Coelenterazine)Enzyme structuresFireflyRenilla为什么要使用双报告基因报告基因 A (首要信号) 报告基因 B (第二信号)特异生物学反馈 + 非特异生物学反馈非特异生物学反馈检测结果比较首要与第二信号确定 特异生物学反馈传统的双报告基因的缺点传统的双报告基因的缺点 细胞可能有内源脱乙酰基酶 -Gal 或 GUS 活性. CAT, -Gal 和 GUS 检测是终点检测. 不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或- Gal ,的两个报告基因的检测都灵

4、敏而快速双萤光素酶报告基因系统比用CAT和-Gal做内对照的优点 速度 样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内 完成 灵敏 两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内 源萤光素酶背景极低 方便 一管完成检测，样品不必分份用两个萤光素酶做报告基因（萤火虫用两个萤光素酶做报告基因（萤火虫+海肾）海肾）实验质粒萤火虫萤光素酶海肾萤光素酶对照质粒用海肾萤光素酶作对照归一实验变化实验的 (萤火虫萤光素酶) 归一反应 = 对照的（海肾萤光素酶) 数据处理举例数据处理举例第一天萤光素酶活性(RLU)比率归一的活性 样品处理重复（F:R) 变化倍数 对照 5,128 2,511 7,553 3,815 10,555 5,413 7,745 3,9131.981.00 处理 5,1376 4,467 40,712 3,574 88,787 7,654 6,0292 5,23211.525.82 处理B 1587,635 5,144 2988,347 8,832 3409,881 3,564 661,954 5,847113.2157.18第二天 对照 15,529 20,4330.76 21,

5、897 30,8410.71 10,760 13,6200.79 16,062 21,6310.741.00 处理 850,239 20,843 578,951 14,830 943,873 21,788 791,021 19,154 41,3055,81 处理D 114,865 19,3-05 28,967 12,284 313,767 20,246 12,533 17,2780.730.99活性倍数 (F/R)样品 =F/R)对照第二天处理计算如下：活性倍数(791,021/19,154)=（16,062/21,631)= 55.81GloMax 20/20Single tube luminometerGloMax 96 luminometerWhite microplates for luminescencePromega公司出品的双报告基因实验产品 质粒 萤火虫萤光素酶质粒 海肾萤光素酶质粒 叩头虫萤光素酶质粒 检测系统 非均质双报告基因检测系统（通量较低） 均质的双报告基因检测系统（适合高通量，自动化）载体-萤火虫萤光素酶载体pGL3 家族家族?pGL3-Basic?pGL3

6、-Control?pGL3-Enhancer?pGL3-PromoterpGL3-Basic Map内对照载体可能存在的问题内对照载体可能存在的问题辅助报告基因的相对萤光单位 (RLU) 启动子交叉交谈或互相干扰实验刺激给辅助报告基因的不必要的 调节载体载体-海肾萤光素酶报告基因载体海肾萤光素酶报告基因载体第二代第二代第一代第一代 phRL-nullpRL-null phRL-TKpRL-TK phRL-TK (int-) phRL-SV40pRL-SV40 phRL-CMVpRL-CMV phRG-B phRG-TKRenilla 萤光素酶载体系列萤光素酶载体系列 SV40 晚poly(A)内含子MCSphRL-nullhRL 基因T7 启动子HSV TK 启动子 phRL-TKCMV即时早期增强子/启动子phRL-CMVSV40 早期 增强子/启动子phRL-SV40Renilla 萤光素酶载体系列萤光素酶载体系列TK 启动子hRL 基因SV40 晚 poly(A) phRL-TK(Int-)MCS三个读码框的 终止密码子 phRG-B合成 poly(A) 信号 转录停止位点三个读

7、码框的 终止密码子TK 启动子 phRG-TK合成 poly(A) 信号 转录停止位点用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因 Dual-Luciferase 双萤光素酶报告基因系统 （非均质检测） E1910，100次 E1960，E1980，1000次 Dual-GloTM萤光素酶检测系统 （均质检测） E2920，10ml E2940，100ml EE2980，10X100mlDual-Luciferase 双萤 光素酶报告基因系统整和了萤火虫萤光素酶和海肾萤光素 酶检测的先进的辅助报告基因系统整和了萤火虫萤光素酶和海肾萤光素 酶检测的先进的辅助报告基因系统Dual-Luciferase报告基因检测系统组分 检测缓冲液II 底物（冻干粉） Stop&Glo缓冲液 Stop&Glo底物,50X 被动裂解液,5X双萤光素酶检测方案 Luciferase Assay Reagent II1 支试管2 步检测30 秒钟Passive lysis bufferStop&Glo ReagentDLR Assay KineticsDLRTMFor HTSDLR双

8、报告基因检测系统应用举例 原文见: http:/ 增强子控制的萤光素酶的表达的诱导对由人酪氨酸酶启动子 增强子控制的萤光素酶的表达的诱导(Promega eNotes)目的：监测细胞对-MSH诱导的应答 材料： 实验载体：pGL3-Try14A:人酪氨酸酶启动子增强子Luc(+) 阳性对照：pGL3-Control 阴性对照：pGL3-Basic 内对照：pRL-SV40 B16-F1细胞（鼠黑素瘤细胞系CRL-6323) DLR 双萤光素酶检测试剂盒步骤 前一天：接种细胞，六孔板X3 第二天：共转染：pGL3-Try14A和pRL-SV40（分成两组） pGL3-Control和pRL-SV40 pGL3-Basic和pRL-SV40裂解细胞，测量萤光Dual-Glo萤光素酶检测系统萤光素酶检测系统检测特点检测特点均质检测，为高通量检测而设计均质检测，为高通量检测而设计萤光信号稳定，萤光信号稳定，2hrs内检测内检测自发萤光低于检测水平自发萤光低于检测水平均质检测与非均质检测均质检测发光细胞+培养基添加试剂非均质检测发光细胞+培养基清洗细胞裂解细胞添加试剂除去培养基Dual-Glo萤

9、光素酶检测系统试剂盒组成 Dual-Glo萤光素酶缓冲液 Dual-Glo萤光素酶底物（冻干粉） Dual-GloStop-Glo缓冲液 Dual-GloStop-Glo底物操作步骤 试剂制备简单 将Dual-Glo 萤光素酶缓冲液倒入 Dual-Glo 萤光素酶底物 中 用Dual-Glo Stop &Glo 缓冲液按1:100 稀释 Dual-Glo Stop &Glo 底物 所有的缓冲液存于室温, 所有的底物存于 20C 两步加入试剂: 加, 读, 加, 读 10,000 倍信号分离 (淬灭)操作步骤用两个萤光素酶做报告基因-加一次试剂,读两色萤光值Chroma-LucTM载体 Chroma-Glo检测试剂E.Coli 表达的Chroma-LucTM基因Chroma-LucTM基因三个基因三个基因:1. CBRluc 发红光的萤光素酶发红光的萤光素酶2. CBG99luc 发绿光的萤光素酶发绿光的萤光素酶 99.0% DNA 相同于相同于 CBRluc3. CBG68luc -发绿光的萤光素酶发绿光的萤光素酶 68.9% DNA相同于相同于CBRluc合成的 Chroma-LucTM萤光素酶载体骨架SV40 启动子启动子SV40 增强子增强子 ControlBasicEnhancerChroma-LucTM 基因 (合成的或天然的基因)Chroma-

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