初论免疫组化标准化
10页1、 初论免疫组织化学标准化 rKYL王丽 张秋金 林齐心 王小亚 福州 350002OIlC 中华病理技术论坛最权威的病理论坛! - 中华病理学者交流的园地 t2单克隆抗体的问世与免疫组织化学检测系统持续快速的发展,使免疫组织化学技术在现代病理诊断中的应用日益广泛,且倍受病理界的关注与青睐。最初由 70 年代初期仅在实验室中科研的尝试,其间历经二三十年时间,该项技术今日已发展到成为常规病理诊断中必不可少的可靠的辅助诊断手段。由于随着免疫组织化学试剂的大量涌现,1998 年美国 FDA 颁发了免疫组化试剂重新分类标准 ,将其免疫组化试剂抗体统分为三大类,类抗体,在病理鉴别诊断中用于判定组织起源指标;类抗体,为雌、孕激素受体,用于乳腺癌患者中雌、孕激素受体的检测,雌、孕激素受体激素水平的测定以指导患者的内分泌治疗;类抗体,为现今仍处于科研文献论证阶段的新试剂1。试剂的规范化要求越来越受到重视。Po分子医学的发展,治疗性的人源性单克隆抗体引入了临床,免疫组织化学技术已经作为独立的一项检测指标用于指导临床个性化治疗2。目前已有十几种人源性单克隆抗体,通过了临床期实验。代表性的 C-erbB-2
2、在乳腺癌组织中的表达,该项免疫组织化学检测方法已经通过美国 FDA 认证,免疫组织化学检测结果直接指导临床治疗。ER/PR 检测是目前病理科常规开展的免疫组化检查项目,每个实验室都日常进行ER/PR 检测,但值得注意的是每个实验室间得出的实验结果往往大相径庭3,4,5,ER/PR 检测的实验结果直接指导乳腺癌患者的预后与治疗,随着检测方法直接渗透到病人预后与治疗方案中,所以方法学标准化重要性的问题日趋突出与严峻。就免疫组织化学标准化的概念新近由美国国家临床实验标准化委员会(National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS)于 1999 年正式出台了纲要性文件6,7,8。随着国内免疫组织化学技术应用日益广泛,免疫组化实验结果的可靠性、可重现性以及实验室之间的学术交流也愈来愈受到高度重视。实验室间的交流需要采用通用的术语和实验规则,实验室的仪器设备、技术操作规范、实验技术人员的资格等外部环境条件都有必要得到重视9,这些影响因素也常常是令实验室感到棘手的问题,同时免疫组织化学实验技术在实际操作中还仍然存在着许多有待商榷的问题
3、2。尽管在免疫组织化学理论上十分的简单,但日前让每个实验室能够持续稳定地完成可靠的实验染色结果还仍然是颇为困难的事情,因为诸多的因素最终可以影响免疫组化的结果,若想得到最佳可靠的实验结果,当务之急是将免疫组织化学技术中的全部实验程序变得易于操作与掌握,达成概念上的标准化。Y一、免疫组化诊断成功的关键要素 wq1病理科主任2. 切片二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水至水化;$3. 灭活内源性过氧化物酶的活性,缓冲液冲洗;s-G“L|4. 血清封闭孵育,缓冲液冲洗;X#boA35. 如果需要,缓冲液冲洗,抗原修复处理(热抗原修复或酶消化) ;eTh6. 加载相应的一抗,孵育,缓冲液冲洗;=中华病理技术论坛最权威的病理论坛! - 中华病理学者交流的园地 VKmm*(一)染色前(Preanalytic or Pre-Stain)处理因素LiS1取材、脱水、浸蜡“p;2免疫组化要求组织离体后应立即固定,理想的取材厚度是 2mm,组织在脱水机中的处理条件应十分妥当,大量的实验室经验公认在加热抗原修复过程中组织脱片的主要原因是取材过厚以及脱水浸蜡处理不当所致。如果 H中华病理技术论坛最权威的病理论坛! - 中
4、华病理学者交流的园地 Zo3-(三) 、免疫组化染色(Staining)实验操作中应用问题 Hc“s1内源性过氧化物酶的灭活 601t_N在免疫组化染色中若采用过氧化物酶的检测系统,必须进行内源性过氧化物酶封闭处理。如果不进行处理,组织中的红细胞、粒细胞可以干扰染色结果的判断。一般采用比较缓和的方法:0.3%H2O2 进行封闭处理,对染色结果及抗原保存都没有影响。嗜酸性细胞不容易灭活,但在镜下实际观察中较容易被区分开。3%H2O2 对抗原可能轻微的损害,但封闭效果比较显著。u2血清封闭 u,xki实验室使用的封闭血清,一般用在加载一抗之前,血清种属的选择一般与二抗的种属相同,可以减少非特异性显色。一抗中若含有正常血清,也可以免去此步骤。3冲洗步骤 z|DL实验室中常用的冲洗缓冲液为 PBS 和 TBS,Tween20 加入到冲洗缓冲液中可以增强冲洗效果。在实际操作中应严格遵守实验冲洗步骤,防止因冲洗不充分引起的背景着色。n=$J4一抗孵育c即用型抗体(Predilute ready-to-use)厂家已进行过多种实验条件的实验检测,可按照厂家提供的实验操条件进行实验。x=迈新实验室针对
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