初论免疫组化标准化

初论免疫组织化学标准化 rKYL王丽 张秋金 林齐心 王小亚 福州 350002OIlC ©中华病理技术论坛最权威的病理论坛！ - 中华病理学者交流的园地 t2单克隆抗体的问世与免疫组织化学检测系统持续快速的发展，使免疫组织化学技术在现代病理诊断中的应用日益广泛，且倍受病理界的关注与青睐。最初由 70 年代初期仅在实验室中科研的尝试，其间历经二三十年时间，该项技术今日已发展到成为常规病理诊断中必不可少的可靠的辅助诊断手段。由于随着免疫组织化学试剂的大量涌现，1998 年美国 FDA 颁发了免疫组化试剂重新分类标准 ，将其免疫组化试剂抗体统分为三大类，类抗体，在病理鉴别诊断中用于判定组织起源指标；类抗体，为雌、孕激素受体，用于乳腺癌患者中雌、孕激素受体的检测，雌、孕激素受体激素水平的测定以指导患者的内分泌治疗；类抗体，为现今仍处于科研文献论证阶段的新试剂1。试剂的规范化要求越来越受到重视。Po分子医学的发展，治疗性的人源性单克隆抗体引入了临床，免疫组织化学技术已经作为独立的一项检测指标用于指导临床个性化治疗2。目前已有十几种人源性单克隆抗体，通过了临床期实验。代表性的 C-erbB-2 在乳腺癌组织中的表达，该项免疫组织化学检测方法已经通过美国 FDA 认证，免疫组织化学检测结果直接指导临床治疗。ER/PR 检测是目前病理科常规开展的免疫组化检查项目，每个实验室都日常进行ER/PR 检测，但值得注意的是每个实验室间得出的实验结果往往大相径庭3,4,5，ER/PR 检测的实验结果直接指导乳腺癌患者的预后与治疗，随着检测方法直接渗透到病人预后与治疗方案中，所以方法学标准化重要性的问题日趋突出与严峻。就免疫组织化学标准化的概念新近由美国国家临床实验标准化委员会（National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS）于 1999 年正式出台了纲要性文件6,7,8。随着国内免疫组织化学技术应用日益广泛，免疫组化实验结果的可靠性、可重现性以及实验室之间的学术交流也愈来愈受到高度重视。实验室间的交流需要采用通用的术语和实验规则，实验室的仪器设备、技术操作规范、实验技术人员的资格等外部环境条件都有必要得到重视9，这些影响因素也常常是令实验室感到棘手的问题，同时免疫组织化学实验技术在实际操作中还仍然存在着许多有待商榷的问题2。尽管在免疫组织化学理论上十分的简单，但日前让每个实验室能够持续稳定地完成可靠的实验染色结果还仍然是颇为困难的事情，因为诸多的因素最终可以影响免疫组化的结果，若想得到最佳可靠的实验结果，当务之急是将免疫组织化学技术中的全部实验程序变得易于操作与掌握，达成概念上的标准化。Y一、免疫组化诊断成功的关键要素 wq1病理科主任2. 切片二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水至水化；$3. 灭活内源性过氧化物酶的活性，缓冲液冲洗；s-G“L|4. 血清封闭孵育，缓冲液冲洗；X#boA35. 如果需要，缓冲液冲洗，抗原修复处理（热抗原修复或酶消化） ；eTh6. 加载相应的一抗，孵育，缓冲液冲洗；=©中华病理技术论坛最权威的病理论坛！ - 中华病理学者交流的园地 VKmm*（一）染色前（Preanalytic or Pre-Stain）处理因素LiS1取材、脱水、浸蜡“p;2免疫组化要求组织离体后应立即固定，理想的取材厚度是 2mm，组织在脱水机中的处理条件应十分妥当，大量的实验室经验公认在加热抗原修复过程中组织脱片的主要原因是取材过厚以及脱水浸蜡处理不当所致。如果 H©中华病理技术论坛最权威的病理论坛！ - 中华病理学者交流的园地 Zo3-（三） 、免疫组化染色（Staining）实验操作中应用问题 Hc“s1内源性过氧化物酶的灭活 601t_N在免疫组化染色中若采用过氧化物酶的检测系统，必须进行内源性过氧化物酶封闭处理。如果不进行处理，组织中的红细胞、粒细胞可以干扰染色结果的判断。一般采用比较缓和的方法：0.3%H2O2 进行封闭处理，对染色结果及抗原保存都没有影响。嗜酸性细胞不容易灭活，但在镜下实际观察中较容易被区分开。3%H2O2 对抗原可能轻微的损害，但封闭效果比较显著。u2血清封闭 u,xki实验室使用的封闭血清，一般用在加载一抗之前，血清种属的选择一般与二抗的种属相同，可以减少非特异性显色。一抗中若含有正常血清，也可以免去此步骤。3冲洗步骤 z|DL实验室中常用的冲洗缓冲液为 PBS 和 TBS，Tween20 加入到冲洗缓冲液中可以增强冲洗效果。在实际操作中应严格遵守实验冲洗步骤，防止因冲洗不充分引起的背景着色。n=$J4一抗孵育c即用型抗体（Predilute ready-to-use）厂家已进行过多种实验条件的实验检测，可按照厂家提供的实验操条件进行实验。x=迈新实验室针对即用型抗体稳定性与长期保存有效性的问题做了一项实验研究，进行了长达一年时间对照追踪实验观察，随机选择 5 种常用即用型抗体，p53、ER、CK(AE1/AE3)、EMA 和 CD45RO 进行效期实验，将 5 种即用型抗体放在 37恒温箱内，按时间进展进行效期实验，每次 5 种抗体分别在相同时间里进行相同条件的免疫组化染色实验并观察其实验结果，360 天的实验结果见右图，可以看出，即用型抗体在 37条件下稳定性可以保持 180 天之久，4冷藏条件下存放 24 个月是稳定可靠的，所以合格的即用型抗体是经得起时间考验的，可以作为病理科常规免疫组化首选试剂，使用简单方便，易于标准化操作。同时实验也证明抗体在冷藏运输途中，一般不会引起抗体效价的降低情况。引起抗体效价降低的主要原因是反复的冻融与反复从冰箱中取出，容易导致抗体活性的损失。m:u浓缩型抗体一般按照厂家提供的建议稀释度，进行成倍数稀释预实验。举例，如果某一抗体厂商建议稀释度为 1:50，实验要进行 1:25，1:50，1:100, 1:200, 1:400 梯度滴度实验。选定最佳的稀释滴度后再进行批量实验。关键注意点是要保证在已知阳性的切片中抗体滴定到完全没有阳性反应为止。一般染色背景深大多是抗体浓度过高所致。抗体孵育温度一般以常温 25为基准或 4冰箱过夜。WyW5检测系统_YY通用的检测系统为生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的检测方法有 SP、LSAB、ABC 等，都是目前实验研究与临床实验室广泛采用的检测方法，其方法简便易行，试剂稳定。SP 三步法敏感度大于EnVision,、EliVision，大约 1-2 倍。SP 三步法高效、经济，为国内免疫组化首选的检测系统。j6显色系统 vci?Z通常采用的是辣根过氧化物酶系统，因此选择 DAB（棕色）和 AEC（红色）酶底物，若采用碱性磷酸酶系统则选择 BCIP/NBT（蓝紫色）,常规免疫组化显色首选的仍然是 DAB，定位清晰，易于保存。 7复染 03“)尽管衬染步骤十分简单，但衬染的好坏对染色最终结果的质量影响很大。苏木素有不同类型，首选的是Harris 苏木素衬染，Harris 苏木素在水中应彻底洗涤，才可以得到亮丽的兰色衬染效果，且与 DAB 染色对照效果最好，在绝大多数实验室中使用简单方便。MQ*D,S©中华病理技术论坛最权威的病理论坛！ - 中华病理学者交流的园地 cou9j（四） 、免疫组化对照实验的设立'#>1Vimentin 阳性对照/50fj:Vimentin 在免疫组化中作为阳性对照是由 Battifora33提出，他提出在每次实验中增加 Vimentin 染色作为对照，目的是观察组织经福尔马林固定后预期抗原表达的敏感性，按福尔马林固定后抗原损伤的程度来进行分析。Vimentin 几乎在任何组织中都有表达，尤其优选于活检组织中的免疫组化染色观察。在与上皮组织相连接的间质中存在着大量的血管 Vimentin 可阳性表达，如果在同一张切片的间质中出现 Vimentin 染色微弱或部分区域变弱的情况，表明是过度固定导致抗原破坏。所以在每批次实验中应常规加入 Vimentin染色，用于指导观察福尔马林固定后抗原表达敏感性情况。迈新实验室随机选择福建省四家省级医院病理科的 81 个各种组织蜡块，进行 Vimentin 标记批量实验，结果观察显示 Vimentin 在组织中的表达率为96.7%(85/88 )。 2实验阳性对照设立 WJ,;|1阳性对照如何设立才是最佳？病理技术人员可能在日常一次又一次的免疫组化实验中，总在疑问选择何种对照才是合理的标准化实验对照，而且这一点也是目前一般实验室中最容易忽视的问题。如果一个相同的组织蜡块同时要做多种指标染色如 CK、EMA、LCA、S-100 和 HMB-45 时，仅需做一张阴性对照即可，无需同时做五张切片作对照34。但要保证阴性对照的实验处理条件要与一抗处理条件相同，一般常规免疫组化阳性对照的设立见附表。iJ目前国外一些实验室已采用多肿瘤组织芯片来测定抗体的特异性35，组织芯片中包含有 15-80 种不同类型肿瘤组织（包括各种癌、神经内分泌肿瘤，肉瘤，黑色素瘤，淋巴瘤等等。 ）目的是观察抗体在各种肿瘤或组织中是否有交叉反应，已取得满意的效果，国内北京友谊医院病理可采用多组织芯片对照技术，48种不同正常或肿瘤组织对照，取得极好的效果，有条件的实验室也应尽快采用。c0©中华病理技术论坛最权威的病理论坛！ - 中华病理学者交流的园地 Gpy对照设立 O对照设立 K靶组织 实验反应 实验试剂$aGbVimentin 对照 a-wo_Vimentin 在间质组织中表达 反应组织固定情况 福尔马林过度固定将导致 Vimentin 免疫活性丢失'阳性组织对照 Mbsdq组织中含待测抗原 一抗与靶抗原特异性的结合的有效性 测试一抗的免疫活性U|dk阴性组织对照Q组织中不含待测抗原 检测与一抗有无交叉反应 一抗非特异性试剂对照“?（除一抗外）l:n5与一抗待测组织相同 综合分析病人标本中观察有无非特异性反应， 了解待测组织中非特异性试剂的反应$5R自身组织对照 ex相同组织蜡块连续切片 固定、处理程序不同于对照片 一抗 =m“©中华病理技术论坛最权威的病理论坛！ - 中华病理学者交流的园地 6b,S/（五）真阳性与假阳性的判定 z实验染色结果的观察判断中，真阳性与假阳性的判定需要丰富的经验，真阳性染色结果应表达在预期对应的组织结构的抗原中，定位清晰准确，假阳性一般出现在非预期对应的组织抗原中。采用过氧化物酶检测系统，DAB 显色所得出的“棕色”染色结果并非都是真阳性，假阳性一般较容易判定，因为假阳性在组织细胞结构中缺少细胞与细胞间的同质性，散在性分布。个别抗体偶尔出现定位异常，如 CD20 (L26) 偶见核表达36。而且强调指出，阴性对照切片的实验抗原修复条件必须与一抗切片的实验条件完全一致，避免内源性生物素造成的人为假阳性以干扰染色结果的判断。©中华病理技术论坛最权威的病理论坛！ - 中华病理学者交流的园地 J$Pk（六）免疫组化染色后(Post-Staining)的分析注意要点“免疫组化染色后染色结果的分析与解释，依靠的是医生大脑的分析，再好的技术目前还不足以能够替代人脑的综合分析。病理专家和病理技术人员能够很好地识别真假阳性是很重要的，若要发挥免疫组化染色在病理诊断中的最大优势，病理医生必须对该使用的标记物的免疫反应类型与染色结果的判断与解释应十分的熟悉，仅仅知道抗体的名字是远远不够的，否则很容易将抗体的解释误入歧途。比如部分淋巴瘤中可以出现上皮膜抗原（EMA）的表达,这并不罕见。再者 NSE 也不是神经内分泌细胞特异性的标记物，如果在免疫组化诊断中把 NSE 看作是神经内分泌细胞的特异性标记物，那将是盲目有害的。3Hr4FW免疫组化在鉴别诊断中的原则强调的是联合应用，组合配套（Panel）表达是至关重要的。当一例病例需要进行鉴别诊断时，病理医生首先要清楚