实验一底物浓度对酶促反应的影响
5页1、实验一 底物浓度对酶促反应的影响1、 实验目的掌握底物浓度对酶活性的影响,了解碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AKP)的Km值的测定原理和方法,理解Km值的意义。二、实验原理在温度、pH及酶浓度等恒定的条件下,底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。当底物浓度较低时,酶促反应速度V随底物浓度S的增高而显著加快,随着底物浓度渐高,反应速度加快程度渐小,当底物浓度增加到一定程度以上时,再增高底物浓度,反应速度亦不再增加,成为该条件下极限最大反应速度Vmax。底物浓度与反应速度的这种关系可以用下列米曼(Michaclis-Menten)氏方程式表示。V=或Km=S( 1)式中,Km为米氏常数。当V=Vmax/2时,则Km=S,即米氏常数是反应速度等于最大速度一半时底物物浓度的数值。如图所示: VVmax Km S图1 底物浓度与酶促反应速度的关系Km是酶的特征性常数,不同酶的Km值不同,同一酶作用于不同底物的Km值亦不同。大多数纯酶的Km值在0.01100mmol/L之间。Km值的测定在酶学研究中有重要的实际意义。根据实验结果绘制上述直角双曲线,难以准确求出Km和Vmax
2、值。而用米曼氏方程式的下列变换式,则容易求得Km及Vmax值。米曼氏方程式中各项皆采用倒数表示,则成为LineweaverBurk氏方程式:=+ 如图所示: 斜率= 图2 LineweaverBurk氏法作图求Km值这是个上截式直线方程式。与为直线关系,如上图。直线斜率为,纵轴截距为,横轴截距为.据此可以测定不同浓度底物的反应速度,按与关系作图而容易正确得出Km值。另有其他变换式,例如把上式两侧皆乘以S,则转换成Wilkinson氏方程式。=+S如图所示:斜率=-K m S图3 Wilkinson氏法作图求Km值这也是直线方程式。以为纵轴,S为横轴作图,则直线在横轴上的截距为Km.本实验利用磷酸苯二钠法测定不同浓度底物的碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AKP)的反应速度,作图求出Km值。AKP的催化原理为:在一定pH和温度下,待测液中的AKP作用于基质液中的磷酸苯二钠,使之水解释放出酚。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林(AAP)作用并经铁氰化钾氧化,生成红色醌类化合物。以酚作标准液同样处理显色进行比色,可测知酚的生成量,从而计算出酶的活力。三、实验器材试管、37
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