登革病毒核酸检测试剂注册技术审查指导原则（2020年）

1、附件登革病毒核酸检测试剂注册技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对登革病毒核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。本指导原则是对登革病毒核酸检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。一、适用范围 登革热是由登革病毒（dengue virus，DV）引起的一种急性传染病，广泛流行于全球热带及亚热带地区，通常由蚊媒传播。登革病毒感染可表现为无症状隐性感染、非重症感染及重症感染等。典型的登革热病程分为三期，即急性发热期、极期和恢复期。登革病毒属黄病毒科黄病毒属，为RNA病毒，

2、基因组由单股正链RNA组成，共有4个血清型（DENV-1、DENV-2 DENV-3和DENV-4），4种血清型均可引起登革热的感染和流行，各型病毒间抗原性有交叉。与寨卡病毒、乙脑病毒、西尼罗病毒等其他黄病毒抗原性有交叉。登革病毒感染的常用的实验室检测包括血常规、血生化检查、病原学和血清学检查等。核酸检测是登革热病原学检测的重要参考。我国登革热诊疗指南（2014年第2版）中，明确：患者急性发热期可应用登革病毒核酸检测进行早期诊断。疑似或临床诊断病例，急性期血清检测出病毒核酸，可作为确诊依据。我国卫生行业标准登革热诊断（WS 2162018），也将登革病毒RNA检测列入登革热病原学检测方法，用于登革热的早期诊断。登革病毒核酸检测试剂是指：利用分子生物学检测技术，如逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）等，以登革病毒共有的核酸序列为检测靶标，对血液样本中的登革病毒进行体外定性检测的试剂，用于登革热的辅助诊断。本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法建立的，对于其他分子生物学检测技术，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的

3、评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。本指导原则适用于以登革病毒共有的靶核酸序列作为靶标进行检测的试剂，对于预期用途为登革病毒分型核酸检测试剂，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。二、注册申报资料要求（一）综述资料综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及国内外同类产品上市情况介绍等内容。其中，同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学、检验原理、最低检测限及被测靶核酸序列的特性等方面写明申报试剂与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。若被测物为新的靶核酸序列，则应详细论述检测靶标与登革热诊断的相关性，并提供充分的支持资料。综述资料应符合体外诊断试剂注册管理办法（国家食品药品监督管理总局令第5号，以下简称办法）和关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。（

4、二）主要原材料的研究资料应提供主要原材料如引物、探针、酶、阴性对照、阳性对照、内对照以及企业参考品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量控制标准等的研究资料。若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定；如主要原材料购自其他供货商，应提供的资料包括：供货商提供的质量标准、出厂检定报告或性能指标证书，以及该原材料到货后的质量检验资料。申请人应提供企业参考品的详细制备过程，包括组成、来源、毒株特性（如名称、型别、浓度）、溯源及定值资料等信息。企业参考品的项目应包括：阴性参考品、阳性参考品、最低检测限参考品、重复性参考品等。阳性参考品应包含DENV-1、DENV-2 DENV-3和DENV-4型标准毒株或临床分离株；阴性参考品则主要涉及对分析特异性（交叉反应）的验证情况；精密度参考品应至少包含两个浓度水平，其中包含弱阳性水平。建议采用灭活的毒株建立企业参考品，不宜仅采用质粒、假病毒、基因组提取/纯化物等核酸。申报试剂的质控体系应包含阳性、阴性、内对照（内标）等。对样本核酸提取/纯化、配液及加样、试剂及仪器性能、扩增反应抑制物（管内抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假阴性或假

5、阳性结果，进行质量控制。企业应对各种对照的Ct值或相应判断数值做出明确的范围要求。申报资料应详细描述对照的原料选择、制备、定值过程等试验资料。1.内对照（内标）内对照可对实验过程可能存在的扩增反应抑制物、仪器、试剂和操作等所导致的假阴性结果进行质量控制。申请人应对内对照（内标）的目的序列设计、构建进行详细的阐述，并对引物、探针和模板浓度做精确的验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶核酸序列检测造成的抑制而导致假阴性。2.阳性对照阳性对照可对实验完整过程进行质控。阳性对照可为：含有靶核酸序列的病毒样颗粒或灭活的登革病毒标准毒株或临床分离株，浓度水平为高于最低检测限水平的弱阳性或中等阳性。企业应对各种阳性对照的Ct值或相应判断数值做出明确的范围要求。3.阴性对照阴性对照对可能存在的由非特异性引起的假阳性进行质控。阴性对照不含待测靶序列，基质应尽量与待测样本相同或相近。需参与样本核酸的平行提取/纯化。4.空白对照（如适用）由不含模板的缓冲液或样本保存液组成，用于对扩增过程中可能出现的外界靶核酸污染和其他升高的背景进行质控。空白对照需参与样本核酸的平行提取/纯化。对于一些经

6、特殊设计的检测试剂，可不常规设置空白对照。如：采用单管独立反应体系进行检测的试剂。此时应详述不进行设置的考虑。5.核酸提取/纯化组分（如适用）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。6.PCR组分的主要材料（包括引物、探针、各种酶及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：6.1脱氧三磷酸核苷（dNTP）对纯度、浓度、保存稳定性等的详细资料。6.2引物和探针需提供靶序列选择的研究资料；引物、探针的设计资料，包括设计原则、序列信息，设计合理性分析等，需提供对序列准确性、纯度、浓度、稳定性、功能性实验等的详细资料。如为外购，还应提供合成机构出具的合成产物的质检证明。6.3 PCR反应所需酶DNA聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，如：94保温1小时后仍保持50%活性；应提供有关外观、保存稳定性、活性及功能实验等的详细资料。逆转录酶，应具有聚合酶活性，在适宜温度条件下可进行有效的逆转录反应。应提供有关外观、保存稳定性、活性及功能实验等的验证资料。7. RNase抑制剂（如适用）可抑制RNA酶可能造成的污染。应提供外观、活性及功能性试验的验证

7、资料。（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料主要生产工艺包括：配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH等关键参数进行有效控制。生产工艺研究资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本用量、试剂用量、反应条件、质控体系设置、Ct（临界）值确定等，提供确切的依据，主要包括以下内容：1.主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。2.对生产工艺主要控制点进行阐述。3.核酸提取/纯化方法确定的研究资料。4.确定最佳PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度、样本量及反应体积等。5.确定PCR反应各阶段温度、时间及循环数的研究资料。6.对于基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。（四）分析性能评估资料企业应提交在产品研制阶段对申报试剂进行的所有性能验证的研究资料，包括具体的试验方法（操作步骤）、内控标准、实验数据、统计分析等详细资料。对于登革病毒核酸检测试剂，建议着重对以下分析性能进行研究。1.检出能力1.1最低检测限的确定建议使用DENV-1DENV-4型培养后的登革病毒

8、原液的梯度稀释液来确定最低检测限。应采用与待测样本类型一致的样本进行稀释。每个浓度梯度重复35份，每份进行不少于20次的重复检测，将具有95%阳性检出率的浓度作为最低检测限。应明确毒株的来源、浓度、浓度的确定方法和制备稀释方法等信息。企业可采用半数组织感染量测定法（TCID50）的方法进行毒株浓度的确认，以TCID50/mL作为毒株浓度的表示方式；也可采用空斑形成单位（PFU）的方法进行毒株浓度的确认，以PFU /mL作为毒株浓度的表示方式进行毒株浓度的确认。1.2最低检测限的验证在最低检测限或接近最低检测限浓度对DENV-1DENV-4型登革病毒进行验证。每个血清型应至少选择多个流行毒株进行验证。企业应能够提供用于最低检测限验证的各个毒株的来源、制备方法及浓度等信息。1.3 申请人应明确申报产品最低可检出的登革病毒拷贝数水平，并提供确定过程及相关的实验数据，本研究应针对四种不同的血清型分别进行确认。2.分析特异性2.1交叉反应交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下几方面：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状的和常见感染的其他病原体。具体目录参见表1。建议在病原体感染的医学相关

9、水平进行交叉反应的验证。建议进行交叉反应验证的细菌的最低浓度为106 CFU/mL（CFU：菌落形成单位）；进行交叉反应验证的病毒，如可进行体外培养，其最低浓度为1105 TCID50/mL。应提供用于交叉反应验证的病原体的制备方法、来源、种属和浓度等信息。对于某些难以培养或者因为生物安全性无法培养的病原体，可采用病原体核酸样本进行交叉反应的验证。应提供用于交叉反应验证的病原体核酸的来源、组成和浓度等信息。采用病原体核酸样本进行试验时，应将核酸样本视为实际使用过程中参与PCR反应的核酸样本，根据试剂说明书的要求配制PCR反应体系，进行扩增。有关交叉反应验证的信息应以列表的方式在产品说明书的【产品性能指标】项中体现。表1 用于交叉反应研究的病原体乙型脑炎病毒*森林脑炎病毒*黄热病病毒*圣路易脑炎病毒寨卡病毒*丙型肝炎病毒*西尼罗病毒伯氏疏螺旋体钩端螺旋体基孔肯雅病毒*新疆出血热病毒加利福尼亚脑炎病毒EB病毒麻疹病毒风疹病毒巨细胞病毒单纯疱疹病毒东部马脑炎病毒汉滩病毒汉城病毒发热伴血小板减少综合征病毒普马拉病毒西尼罗病毒甲型流感病毒乙型流感病毒注：*标注的为必做项目2.2干扰物质潜在的干扰物质主要包括：内源性物质（如脂血、溶血、黄疸等）、抗凝剂干扰和外源性药物。 建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度(最差条件)条件下，采用包含弱阳性样本在内的至少两个登革病毒浓度水平的样本进行干扰研究。对于常见药物干扰试验，建议参照相应药物药代动力学研究确定的治疗药物浓度添加相应药物进行干扰验证。表2 用于干扰研究的物质抗病毒药：如利巴韦林对乙酰氨基酚抗生素（如：阿莫西林）激素类药物：如地塞米松肝素EDTA枸橼酸钠人基因组DNA白蛋白注：建议以上干扰物质均进行验证3.精密度测量精密度的评价方法并无统一的标

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