拟南芥酵母文库构建
4页1、拟南芥酵母文库构建一材料:1total RNA trizol 法提取 1mgRNA(两批材料):拟南芥 7 天幼苗全株:250ug14 天幼苗全株:250ug早期花序:已刚看见花蕾,未抽薹为准,250ug晚期花序:已开花的花序,250ug2total RNA 1mg 经 promega mRNA isolation 试剂盒 纯化 沉淀 浓缩 成 10ul。3BD Matchmaker Library construction 试剂盒第一链合成:Synthesize First-Strand cDNA using an Oligo (dT) Primer1. Combine the following reagents in a sterile 0.25-ml microcentrifuge tube:3ul mRNA 1.0 l CDS III Primer4.0 l Total volume2. Mix contents and spin briefly.3. Incubate at 72C for 2 min.4. Cool on ice for 2 min.5. Spin bri
2、efly.6. Add the following to the reaction tube:2.0 l 5X First-Strand Buffer1.0 l DTT (20 mM)1.0 l dNTP Mix (10 mM )1.0 l MMLV Reverse Transcriptase9.0 l Total volume7. Mix gently by tapping. Spin briefly.8. Incubate at 42C for 10 min.9. Add 1.0 l BD SMART III Oligonucleotide.10. Incubate at 42C for 1 hr.11. Place the tube at 75C for 10 min to terminate first-strand synthesis.12. Cool the tube to room temperature, then add 1.0 l (2 units) RNase H.13. Incubate at 37C for 20 min.15. Any first-stran
3、d reaction mixture that is not used right away should be placed at 20C.First-strand cDNA can be stored at 20C for up to three months.4. BD Matchmaker Library construction 试剂盒 ds cDNA 扩增:Amplify ds cDNA by Long Distance PCR (LD-PCR)1. Preheat the PCR thermal cycler to 95C.2. 2 l First-Strand cDNA70 l Deionized H2O10 l 10X BD Advantage 2 PCR Buffer2 l 50X dNTP Mix2 l 5 PCR Primer2 l 3 PCR Primer10 l 10X GC-Melt Solution2 l 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix100 l Total volume3. Mix gently by flickin
4、g the tube. Centrifuge briefly.4. Cap the tube and place it in a preheated (95C) thermal cycler.5. Begin thermal cycling. If you have a hot-lid thermal cycler, use the following program: 95C 30 sec 20 cyclesa:95C 10 sec68C 6 minb 68C 5 min.6. When the cycling is complete, analyze a 7-l aliquot of the PCR product from each samplealongside 0.25 g of a 1-kb DNA size marker on a 1.2% agarose/EtBr gel. Typical resultsobtained with Human Placenta Poly A+ RNA are shown in Appendix A. If your PCR produc
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