八高效液相色谱

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,二、高效液相色谱原理,高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测高压：,150-350*10,5,Pa,高效：大于,30000,塔板,/,米,高灵敏：,10,-9,g,（紫外检测）、,10,-11,g,（荧光检测）,第,1,页,/,共,40,页,三、,HPLC,的特点,HPLC,在高压下使液体通过色谱柱，在室温条件下分离混合组分，经检测器转变成电信号，由记录器描记或数据处理装置显示测定结果，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点1.,高压,：由于,HPLC,是以液体作为流动相，而液体比气体通过色谱柱时所受的阻力要大得多，所以必须施加高压，一般为,15-30MPa,，最高可达,50MPa,2.,高速,：由于,HPLC,采用了高压，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数,10,分钟，比经典的液相柱色谱要快得多，但比,GC,稍慢。

第,2,页,/,共,40,页,3.,高效,：由于,HPLC,的柱效较高,(,每米塔板数可达,5000),，有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分4.,高灵敏度,：采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出,10,-9,g,乃至,10,-11,g,的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析由于,HPLC,具有以上特点，所以,70,年代以来得到了迅速的发展一般认为，对于有机物的色谱分析，,当其相对分子质量小、沸点较低时，可用,GC,进行分析；当沸点较高,(,450),、不能气化或热稳定性差者，可用,HPLC,分析,；如果条件不允许，无法购置昂贵的仪器时，可用,TLC,等经典液相色谱进行分析第,3,页,/,共,40,页,高效液相色谱系统,第,4,页,/,共,40,页,第,5,页,/,共,40,页,液相色谱仪器,high performance liquid chromatograph,第,6,页,/,共,40,页,液相色谱仪（,2,）,第,7,页,/,共,40,页,液相色谱仪（,3,）,第,8,页,/,共,40,页,四、,HPLC,的分类,HPLC,可以分为很多类别，按分离机制可分以下几种主要类型。

1.,液固吸附色谱,以吸附剂为固定相，以不同极性的溶剂为流动相，根据试样中各组分吸附能力的不同而进行分离的方法，称液相吸附色谱在,HPLC,中常用全多孔型硅胶微粒为吸附剂，直径,5-10m,，由于颗粒小且多孔，故柱效很高2.,液,-,液分配色谱,流动相与固定相均为液体的色谱法，称液,-,液分配色谱法或简称液,-,液色谱法，按照固定相和流动相极性的差别，可分为正相与反相色谱法两类第,9,页,/,共,40,页,(1),正相液液色谱法,流动相极性小于固定相的液,-,液色谱法称正相液,-,液色谱法,洗脱时，极性小的组分先流出色谱柱，极性大的组分在固定相中溶解度大，后流出色谱柱原始的正相色谱以,含水硅胶为固定相,，以,烷烃等为流动相,，由于固定液易流失，已被化学键合相色谱法取代化学键合相是将固定液用化学键键合在载体表面形成的固定相正相色谱常用的,氰基键合相,，性质与硅胶类似，只是保留时间略小氨基键合相,的氨基为碱性，与硅胶的性质差异较大，常用于糖类的分析正相色谱以有机溶剂为流动相，使用,成本较高,第,10,页,/,共,40,页,(2),反相液,-,液色谱法,流动相极性大于固定相的液,-,液色谱法称反相液,-,液色谱法,，洗脱时样品中极性大的组分先流出色谱柱。

为了防止固定液的流失，反相色谱法均使用化学键合相，典型的反相化学键合相，用多孔性载体上化学键合的,十八烷基,(octadecysilyl,缩写,ODS,或,C,18,),为固定相，,流动相常用甲醇,-,水或乙腈,-,水,非典型反相色谱系统，由弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相构成反相键合色谱法固定相不流失，流动相以水为主，用甲醇或乙腈调节极性，,应用范围很宽，且使用成本低,，在,HPLC,中应用最广第,11,页,/,共,40,页,1,分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异,2,固定相：载体,+,固定液（物理或机械涂渍法）,缺点：系统内部压力大，易流失，不实用,固定液,极性,固定液,非极性,3,正相色谱,固定液极性,流动相极性,极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱,适于分离极性组分,流动相为正己烷等反相色谱,固定液极性,流动相极性,极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱,适于分离非极性组分，流动相主要为甲醇或水的溶,液等，,液液分配色谱法总结,第,12,页,/,共,40,页,五、,HPLC,的仪器构成,高效液相色谱仪通常由溶剂输送系统、进样系统、色谱分离系统和检测记录系统四部分组成。

1.,高压泵：,由于,HPLC,的固定相颗粒很小，柱阻力很大，故载液必须用,高压泵,来输送，通常柱前压达,15-30MPa,，才能获得高速的液流，以达到快速分离目的载液要预先,脱气,，流路中不应产生气泡，并要避免,尘粒,，以免堵塞泵和柱子，故使用前载液常在减压下通过,0.45m,的滤膜进行,过滤和脱气,有时还用,梯度洗脱装置,，使载液的组成,(,浓度、离子强度、极性和,pH,值,),随时间而连续改变，以提高色谱分离的效果第,13,页,/,共,40,页,2.,进样系统：,为了将试样有效地送入色谱柱，可用微量注射器通过,六通进样阀,的进样口注入样液；亦可将样液先注入与柱头相连的贮样环管，然后利用切换阀让载液将样品定量地送入色谱柱3.,色谱柱：,HPLC,所用的色谱柱大多为内径,2mm,、长度,0.3m,左右的直形短柱固定相可通过干法或湿法在高压下装入色谱柱，要求填充均匀多数使用者可直接购置各种类型的,预装柱,，在使用过程中由于杂质污染往往使柱效逐渐降低，因此，,每次测定后要用流动相慢速,(0.1mL/min),冲洗柱子，使其再生,加预柱也是保护色谱柱延长使用寿命的好办法第,14,页,/,共,40,页,色谱柱的构成,色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。

柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关色谱填料：经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是,5-10,粒径的球形颗粒色谱柱管：内部抛光的不锈钢管典型的液相色谱分析柱尺寸是内径,4.6mm,，长,250mm,色谱柱：也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的第,15,页,/,共,40,页,柱体为直型不锈钢管，内径,1-6 mm,，柱长,5-40 cm,发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效第,16,页,/,共,40,页,4.,检测器：,用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置检测器利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当溶质从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰的形式记录下来目前应用较多的是紫外检测器、差示折光检测器和荧光检测器第,17,页,/,共,40,页,4.,检测器：,用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置检测器利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当溶质从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰的形式记录下来目前应用较多的是紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器。

第,18,页,/,共,40,页,a.,紫外检测器,是基于试样中的待测组分对特定波长的紫外光有选择性的吸收，其吸光度与组分消光度成正比的关系进行检测的很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此,UV-VIS,检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围用,UV-VIS,检测时，为了得到高的灵敏度，常,选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长,，但为了选择性或其它目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长，另外，应尽可能,选择在检测波长下没有背景吸收的流动相,第,19,页,/,共,40,页,a.,紫外检测器,应用最广，对大部分有机化合物有响应特点：,灵敏度高；,线形范围高；,流通池可做的很小（,1mm 10mm,，容积,8L,）；,对流动相的流速和温度变化不敏感；,波长可选，易于操作；,可用于梯度洗脱第,20,页,/,共,40,页,b.,光电二极管阵列检测器,光电二极管阵列检测器：,1024,个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示第,21,页,/,共,40,页,第,22,页,/,共,40,页,示差折光检测器,是利用,连续测定流通池中溶液折射率的变化来测定试液浓度的检测器。

由于溶有待测组分的流动相与参比流动相之间折射率的差值，与待测组分在流动相中的浓度成正比,，故可根据折射率的改变来测定待测组分的含量原理,：基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，,会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比第,23,页,/,共,40,页,绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以是一种通用的检测方法虽然其灵敏度比其他检测方法相比要低,1-3,个数量级对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用第,24,页,/,共,40,页,c.,示差折光检测器,（,differential refractive index detector,）,除紫外检测器之外应用最多的检测器；,可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；,灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；,偏转式、反射式和干涉型三种；,第,25,页,/,共,40,页,示差折光检测器,第,26,页,/,共,40,页,荧光检测器,是根据某些物质,在紫外光照射下具有荧光,的特性来检测的，具有很高的灵敏度，,适用于检测有,-,共轭体系的大分子及结构复杂的化合物，如蛋白质、氨基酸、维生素、稠环芳烃等,。

有些无,-,共轭体系的分子通过柱前衍生法引入荧光基团亦可用荧光检测器检测第,27,页,/,共,40,页,原理：,许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，,被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反应衍生化后检测特点：,有非常高的灵敏度和良好的选择性，,灵敏度要比紫外检测法高,2-3,个数量级而且所需样品量很小,，特别适合于药物和生物化学样品的分析第,28,页,/,共,40,页,d.,荧光检测器,（,fluorescence detector,）,高灵敏度、高选择性；,对多环芳烃，维生素,B,、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,第,29,页,/,共,40,页,5,、定性定量方法,（数据处理系统）,HPLC,定性、定量的原理与气相色谱法相同，有纯物质标准品时，,可用纯物质的保留时间或调整保留时间与样品中相应组分的对比来定性,无纯物质标准品时，通常用,HPLC-MS(,质谱,),联 用仪或,HPLC-FTIR,(,干涉分光型红外分光光度计,),联用等方式定性,，但仪器间的接口技术比气相色谱与光谱仪器联用复杂。

第,30,页,/,共,40,页,定量方法与气相色谱法基本相同但由于很难查到相同实验条件下的定量校正因子，故使用校正归一化法较少由于,HPLC,进样量较大，而且可以用六通阀定量进样，进样量误差较小，故,常用外标法定量,，一般要用外标工作曲线法检验线性范围及工作曲。