D2定性定量检测

1、D2受体定性定量检测试验1. 膜的制备PBS冲洗过的细胞悬液，3000g,4C离心5分钟。2小心的弃去上层液，用30ml冰凉的缓冲液重新悬浮细胞。（缓冲液I:20mMHEPES缓冲液+10mMEDTA,PH=7.4）。细胞混匀20-30秒，然后39000g,4C离心45min。3. 离心后弃去上层清液，用30ml冰冷的缓冲液再悬浮。（缓冲液U:20mMHEPES缓冲液+0.1mMEDTA,PH=7.4）。4. 细胞混匀20-30S,然后39000g,4C离心45min。5小心的弃去上层液，用5ml冰凉的缓冲液3重新悬浮细胞。（缓冲液川：20mMHEPES缓冲液+0.1mMEDTA+10%甘油,PH=7.4）。6膜蛋白浓度使用Bradford法蛋白定量测定（考马斯-）膜蛋白使用缓冲液川（20mMHEPES缓冲液+0.1mMEDTA+10%甘油,PH=7.4）稀释至U1mg/ml，均分到2ml管中，1ml/管。7.-80C储存。Bradford法蛋白定量测定、实验原理双缩脲法（biuret法）和folin酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的

2、方法。1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。、试剂与器材1试剂:,配制成1.0mg/ml和标准蛋白质溶液，用g球蛋白或牛血清清蛋白（bsa）0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。考马斯亮兰g250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g250,溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。2.器材:1.标准方法取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别力卩入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、

3、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充至U0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlg250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。考马斯亮兰法实验表管号12345678910标准蛋白质（1.0mg/ml）00.010.020.040.060.080.10未知蛋白质（约1.0mg/ml）0.020.040.06蒸馏水0.10.090.080.060.040.0200.080.060.04考马斯亮蓝g250试剂;5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0每管中的蛋白质量（mg）光吸收值（A595）（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座

4、标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。2. 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10100mg/ml），可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml,，空白对照则分别为0.5ml或1.0mlH2O,考马斯亮蓝g250试剂仍加5.0ml，同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29放射性配体结合试验材料和试剂人多巴胺D2受体膜、3H螺哌隆、氟哌啶醇、96孔平板Bindingbuffer:50mMHEPES,10mMMgSO4,5mMCaCI2pH7.4,at4CWashbuffer:50mMHEPES,pH7.4,at4C冷配基储存液：2mM冷配基溶于乙醇中，储存于-20C5Xsolution（50uM）:330uL冷配基（饱和结合试验）1145Xsolution:510-x5X0M,8个浓度梯度冷配基（抑制试验）热配基3H螺哌隆放射性比度：16.2Ci/mmol、浓度：1.0mCi/mL、解离常数：0.0

5、8nM假定Kd=0.4nM,选择10倍Kd（4nM）为反应系统中热配体的最大浓度。85ul5*的工作液装满四管（每管20ul,两管为总结合，两管为非特异性结合）。8个浓度梯度在用前两倍稀释备用。（饱和结合试验）通常在竞争结合试验中330ul的5*工作液装满16管（8个浓度梯度稀释的冷配体两份）（竞争结合试验）膜工作液D2/CHO-K1被制备并稀释成0.05mg/ml因此20ul的工作液即含有1ug的膜蛋白。这一总量已由之前的膜蛋白定量试验确定，所以总结和浓度不能超过加到每管中的CPM的10%。饱和结合试验实验设计1concentrationofthehotligand,8totally总结合60uLbindingbuffer20uLmembraneworkingsolution20uLhotligandworkingsolutionof1concentration两份非特异性结合40uLbindingbuffer20uLmembraneworkingsolution20uLcoldligandworkingsolution20uLhotligandworkingsolutionof1c

6、oncentration两份方法用聚乙烯亚胺溶液预处理微量培养板1、96孔板每个孔加入100ul0.5%的PEI（聚乙烯亚胺，溶于超纯水）在4C孵育30-60分钟可使非标减少。2、平板用millpore真空歧管8-15mmHg过滤，然后每孔用2ml清洗缓冲液（4-8C）清洗。结合反应系统在96孔板混合反应并在摇床上以500rpm的摇速在25C孵育一小时。过滤空管用透明的微孔板封口膜密封，反应系统移到平板上，过滤后的配体受体结合物留在平板上。清洗每个管用3ml清洗Buffer清洗。底部封闭平板底部在用不透明的底部微孔板封口膜封闭前先用清洁的纸和通风橱干燥，每个管中加入20ul水溶性闪烁液，孔板用微孔板封口膜封闭，孔板用闪烁发光计数仪计数1分钟/管。结果分析用以下公式把CPM转换成pmol/mg卩mol/mgprotein=2,2h1DiaffcienqlJCPM/DPMPspecite町测喇ofmembraneslhg）数据在软件上用非线性回归（曲线拟合）的单位点结合（双曲线）处理。程序给出包括Kd，Bmax等结果。AR2接近1被视为一个表明良好的非线性回归的指示。饱和曲线的数据可以得到

7、特异结合/总结合（TOTNSB）/总结合的高比率抑制试验实验设计冷配基的终浓度5X工作液配方10-5M5X104M+40uLbindingbuffer10-6M-55X105M+20uLmembranesolution10-7M5X10-6M+20uLworkingsolutionofcoldligand10-8M5X10-7M+20uLhotligand10-9M5X10-8M10-10M5X10-9M10-11M5X10-10M10-12M5X10-11M用聚乙烯亚胺溶液预处理微量培养板1、96孔板每个孔加入100ul0.5%的PEI（聚乙烯亚胺，溶于超纯水）在4C孵育30-60分钟可使非标减少。2、平板用millpore真空歧管8-15mmHg过滤，然后每孔用2ml清洗缓冲液（4-8C）清洗。结合反应系统在96孔板混合反应并在摇床上以500rpm的摇速在25C孵育一小时。过滤空管用透明的微孔板封口膜密封，反应系统移到平板上，过滤后的配体受体结合物留在平板上。清洗每个管用3ml清洗Buffer清洗。底部封闭平板底部在用不透明的底部微孔板封口膜封闭前先用清洁的纸和通风橱干燥，每个管中加入20ul水溶性闪烁液，孔板用微孔板封口膜封闭，孔板用闪烁发光计数仪计数1分钟/管。结果分析用以下公式把CPM转换成pmol/mg卩mol/mgprotein=2商叫申mt禅ffanc/l阳机PMf即乩血町羽则1ofmembraneslhg）数据在软件上用非线性回归（曲线拟合）的单位点结合（双曲线）处理。把Kd和热配基浓度加入系统程序给出包括IC50,Ki等结果。AR2接近1被视为一个表明良好的非线性回归的指示。

《D2定性定量检测》由会员ni****g分享，可在线阅读，更多相关《D2定性定量检测》请在金锄头文库上搜索。