琼脂糖凝胶电泳标准操作流程
3页1、琼脂糖凝胶电泳操作标准流程一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法,具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术, 此关为能力考核,通关成功后,代表具备操作琼脂糖电泳的能力。二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品,其中有三种构型的分子:共价闭合环状的超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNAIDNAocDNA影响核酸分子泳动率的因素主要还是:1、DNA分子大小;2、琼脂糖浓度;3、DNA构想;4、所用的电压;5、琼脂糖种类;6、电泳缓冲液核酸电泳中常用的染
2、色剂是溴化乙锭(ethidium bromide EB)。溴化乙锭是一种扁平分子,可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时,出现不同的效应。254nm的紫外线照射时,灵敏度最高,但对DNA损伤严重;360nm紫外线照射时,虽然灵敏度较低,但对DNA损伤小,所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高,且对DNA损伤不是很大,所以也比较适用。三、材料、试剂及器具1、材料不同大小的基因组片段; 2、试剂Hind III digest DNA Marker(分子量标准)(TaKaRa);D2000(TianGen); BIOWESTAGAROSE(西班牙琼脂糖);加样缓冲液(6x):溴酚黄;电泳缓冲液(1TAE);溴化乙锭(EB); 3、仪器及器具(1)移液器、吸头、锥形瓶(2)电泳系统:电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。(3)紫外透射仪、微波炉、电子天平四、操作步骤1.器具清洗:首先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净,包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘(EB污染,需独立清洗)。清洗流程为:先用自来水冲洗三次,然后用纯水冲洗三次
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