细胞总蛋白提取方法
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.细胞总蛋白提取方法一、溶液配制1. 100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml称取 NaF 41.99mg，超纯水 8ml 溶解后定容至 10ml。2. 100 mM PMSF3. RIPA 溶液 100ml成分分子量终浓度Tris121.140.6 g5.0 mM (pH 7.4)NaCl58.440.87 g150 mMEDTA372.2437.22 mg1 mMNP-401 ml1%SDS0.1 g0.1%脱氧胆酸钠0.5 g0.5%溶解于 80 ml 超纯水中，待溶解后加入 HCl 调 pH 值至 7.4，定容至 100 ml。使用前加入成分储存浓度加入量终浓度PMSF100 mM10l/1ml1 mMNaF100 mM10l/1ml1 mMAprotinin10g/ l0.2l/1ml2g/ lLeupetin10g/ l0.2l/1ml2g/ l二、方法1. 细胞收取1) 细胞传代至 60mm 培养皿中，待细胞融合约 100%，收集细胞2) 弃培养基，加入 PBS 2ml 清洗培养皿一次，弃 PBS。3) 加入 0.05%胰酶 2ml，37温育 1min。4) 待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个 1.5ml ependorf 管中， 10,000rpm3min，4分两次将细胞收至一个5) 弃上清， 1ml 预冷的 PBS 清洗沉淀， 10,000rpm 3min，46) 重复 PBS 清洗一次1 / 2.7) 弃上清， -80冻存待裂解2. 蛋白提取1) 向细胞沉淀中加入 200lRIPA 缓冲液 (含 1mM PMS 、1mM NaF、2g/ml Aprotinin 、2g/ml Leupetin)，混匀后冰上放置 40mins2) 10,000rpm 15min，4将上清转移至一个新的 ependorf 管中（约 250l）加入缓冲液前先将细胞沉淀敲散，加2 / 2
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