北京市泥鳅倍性检测及其倍性杂交效果研究.doc

大连海洋大学农业推广硕士学位论文MASTERAL DISSERTATION北京市泥鳅倍性检测及其倍性杂交效果研究领类教0宄题导答 文研选指论摘要本研究以北京通州区、大兴区、房山区、吕平区、怀柔区五个区采集泥鳅以及大连海 洋大学动物遗传与工程实验室提供的三倍体及四倍体泥鳅为实验材料利用血涂片法鉴定 北京地区泥鳅的倍性；并对不同倍性泥鳅组成不同的杂交组合进行杂交实验具体结果如下：对北京本地泥鳅的倍性进行了鉴定，发现300尾泥鳅全部为二倍体(2n),未发现三倍 体(3n)和叫倍体(4n),泥鳅卩q倍体(4n)和三倍体(3n>细胞核分别为二倍体(2n)的2.07倍和1.57 倍，接近于四倍体和三倍体所期望的理论值2.00和1.50倍，说明通过测量红细胞核体 积，能够较准确反映出多倍体泥鳅的倍性不同倍性泥鳅(2n、4n)杂交得到的3个杂交组合(2nx4n、4nx2n、4nx4n)，其受精率、 相对孵化率及早期成活率与对照组(2nx2n)相比无显著差异(P>0.05),均具有较高水平，表 明不同倍性泥鳅杂交能够产生成活的后代，从而说明利用二倍体(2n)和叫倍体(4n)杂交获得 三倍体(3n)是可行的。

关键i司：泥鳅，血涂片，倍性，杂交目录MASTERAL DISSERTATION 1第一章文章综述 11泥鳅研宂现状 12泥鳅多倍体产生的机理 22.1泥鳅多倍体产生的方法 22.2自然产生法 22.3人工诱导法 23泥鳅多倍体的鉴定 33.1红细胞核体积测量法 43.2核仁组织区数0法 43.3染色体计数及核型公式法 43.4 DNA 含S:测;法 54泥鳅多倍体的生长发育的状况 54.1多倍体泥鳅的存活力 54.2多倍体泥鳅的性腺发育状况 54.3多倍体泥鳅生长速度的状况 65泥鳅多倍体在生产上的应用及发展前景 6第二章北京市泥鳅倍性鉴定 71材料与方法 71.1实验材料 71.2实验方法 72试验结果 82.1北京五个地区泥鳅倍性鉴定 82.2血涂片观察及红细胞核测量值的比较 103.1我国多倍体泥鳅的分布 123.2泥鳅多倍体鉴定的研宄 12第三章不同倍性泥鳅杂交的效果研究 错误!未定义书签1材料与方法 错误!未定义书签1.1实验材料 错误!未定义书签1.2不同倍性泥鳅杂交方法 错误!未定义书签1.3受精率、孵化率、成活率的测定 错误!未定义书签1.4日常管理 错误!未定义书签。

1.5数据处理 错误!未定义书签2结果 错误!未定义书签2.1杂交后代的受精率、相对孵化率和早期成活率 错误!未定义书签2.2泥鳅苗的比较 错误!未定义书签3讨论 错误!未定义书签结论 错误!未定义书签参考文献 错误!未定义书签第一章文章综述1泥鳅研宄现状泥鳅(M/sgurnt；5 angt/////ccwdcFft/5｝求属鯉形 0 (Cypriniformes) > 嫩科(Cobitidae)，是—种 小型淡水经济鱼类，广泛分布在中国、日本、亚洲大陆东部的小型淡水鱼类［11,在我国主 要分布于辽河以南的大部分地区泥鳅肉质细嫩，味道鲜美，营养价值高，素有"水中人 参"的美誉［2］，受到广大消费者的青睐，市场前景广阔，近年，泥鳅的养殖规模在不断扩 大但目前由于受到过度捕捞及水资源污染等因素影响，我国野生泥鳅的数量和产量正逐 渐减少，因此迫切需要选育泥鳅良种，以获得更高的产量和经济效益多倍体育种技术作为鱼类遗传育种的重要方式之一现已得到广泛的应用自20世纪 50年代以来，国内外先后在三棘刺鱼、鲤、水晶彩鲫等30多种鱼类育种中成功获得优良 的苗种［3］,其中三倍体的异育银鲫、湘云鲫、湘云鲤已应用于生产［4］。

三倍体鱼类在生长优 势、群体产量及抗病力等方而都有二倍体所无法比拟的优势，因此多倍体育种研究对水产 养殖具有重大的意义：同吋，由于三倍体鱼具有不育的特性，三倍体的培育对控制养殖鱼 类的过度繁殖和保护天然种质资源也具有极某重要的意义N关于三倍体鱼的诱导方法， 主要有温度休克(如冷休克、热休克)、静水压休克、化学药物处理和电休克等［41但是经过 大量试验发现，这些方法都存在一定的问题和缺陷，随后研宂利用四倍体与二倍体进行杂 交生产全三倍体的方法，更加安全并能够充分的实现多倍体优势［6］已有研宄资料表明，在我国泥鳅除了二倍体还广泛存在着四倍体［781，而且也存在着少 fi的自然三倍体191及自然六倍体泥鳅UQ1这一特性，恰好为泥鳅多倍体育种方而提供了丰富 的研究材料，天然多倍体泥鳅是我国特有的、非常珍贵的种质资源，在水产遗传育种和养 殖生产上都有着非常重要的价值有学者发现，天然四倍体泥鳅A交(4nx4n>获得的后代具 有正常的1:1雌雄性比，并且产生功能正常的二倍体配子K11，1%而天然叫倍体和二倍体泥 鳅杂交(4nx2n)的三倍体后代的雄性个体不育，但雌性个体却能同时产生大、小两种型号的 卵|131。

由此看出，四倍体泥鳅是可育的，它与二倍体泥鳅杂交可获得三倍体，但三倍体的 育性还有待进一步探讨在我国野生泥鳅种群中自然三倍体泥鳅产生机理：在形成配子的 过程中由于减数分裂前核内有丝分裂，二倍体泥鳅能产生未减数的二倍体卵，当这些二倍 体卵与正常的单倍体精子结合即产生三倍体个体；自然四倍体泥鳅是巾二倍体泥鳅染色体 加倍形成；而自然六倍体泥鳅的产生机理尚不清楚，据推测很可能是由三倍体泥鳅经基因 组加倍而形成在减数分裂过程中极体的正常释放保证了遗传物质的稳定性，正常的二倍 体泥鳅精卵结合后适时抑制第二极体的释放可获得一定比例的三倍体个体；若抑制第一次 卵裂可以得到四倍体个体；若抑制第二极体的释放又抑制第一次卵裂理论上可获得六倍体 个体目前，多倍体育种技术被广泛应用于动物、植物的品种改良泥鳅多倍体育种技术也 不断完善泥鳅的杂交育种技术已比较成熟，如二倍体泥鳅与叫倍体泥鳅杂交可生产全三 倍体泥鳅，二倍体泥鳅产生单倍体配子与四倍体泥鳅产生的二倍体配子结合即可产生三倍 体个体木研宄对北京本地泥鳅的倍性进行了鉴定，观察与比较了不同倍性泥鳅的红细 胞形态及红细胞核的测量值，测定了杂交后代的受精率、相对孵化率及早期成活率，皆为 进一步选育泥鳅良种提供理论依据，同时对我国泥鳅种质资源的保护及合理开发利用有着 重要意义。

2泥鳅多倍体产生的机理2.1泥鳅多倍体产生的方法泥鳅多倍体产生的方法分为为自然产生法和人工诱导法2.2自然产生法所谓的自然产生法就是自然界中处于孵化阶段的受精卵，在外界环境的作用下，如温 度骤变，外力的作用等，抑制第二极体的释放或抑制第一次卵裂即可获得多倍体泥鳅2.3人工诱导法人工诱导法又可分为物理和生物学两种2.3.1物理学方法主要包括温度休克法，静水压法等温度休克法包括冷休克和热休克两种，冷休克通过抑制受精卵第二极体的释放而获得 三倍体，康邵乐等M在二倍体泥鳅卵子正常受精后3~5min，用2C的冷水休克处理 30min,最高得到64%的三倍体率而热休克通过抑制受精卵第一次卵裂而获得叫倍体，南 平等［151在二倍体泥鳅受精后20min左*，采用41〜42C热水休克处理4min,最高获得60% 的四倍体率无论是冷休克还是热休克均不能获得100%多倍体率，而且用热休克法处理受 精卵的死亡率较高，因此温度休克法在实际生产上应用比较受限静水压法采用较高的静水压力抑制第二极体的排放可获得三倍体，在受精后合适的时 间内抑制第一次卵裂可获得叫倍体Suwa等［161在二倍体泥鳅卵受精后5分钟川700kg/cm3 静水压力处理1分钟，获得较高的三倍体率，在受精后30或者35分钟用800kg/cm3静水 压力处理1分钟，获得较高的四倍体率。

2.3.2生物学方法即杂交法，是利用二倍体泥鳅与多倍体泥鳅杂交制备泥鳅多倍体的方法李雅娟等 利用天然四倍体泥鳅与二倍体泥鳅杂交制备了 100%的三倍体泥鳅，这种生物学杂交方法操 作简单，方法可靠，是生产全三倍体泥鳅的最佳途径，可在泥鳅的水产养殖中广泛推广； 生物学杂交法与物理学休克法结合也可获得多倍体泥鳅，Katsutoshi Auai等［17］将四倍体泥 鳅卵子与二倍体精子结合后5分钟，置于39C的水中处理90秒，获得了五倍体泥鳅 (5n=125),二倍体泥鳅的卵子与叫倍体泥鳅的精子结合5分钟后用同样的处理方法获得了 四倍体泥鳅(4n=100)3泥鳅多倍体的鉴定泥鳅多倍体的鉴定方法较多，常见的有红细胞核体积测量法、核仁组织区数0法、染 色体计数和核型公式分析法、DNA含量测量法等3.1红细胞核体积测量法这种方法是根据细胞的倍性与细胞核的体积呈正相关，李雅娟等191的研究结果表明二 倍体泥鳅的红细胞核体积大小是18.74 0.91 U m3,三倍体泥鳅的红细胞核体积是27.84 1.02 um3,四倍体泥鳅的红细胞核体积是37.51 1.56 u m3,即三种泥鳅红细胞核体积比 2n:3n:4n = 1:1.5:2.0；而高泽霞等［181的研究结果显示二倍体泥鳅的细胞核体积为22.02 4.31 Pm3,叫倍体泥鳅的细胞核体积为46.16 7.52 Pm3,二倍体与叫倍体泥鳅红细胞核的体积 比接近1:2。

虽然两项研究中红细胞核体积大小有所差异，但二倍体与四倍体的红细胞核的 体积比是一致的，因而已知的泥鳅红细胞核体积比可作为不同研究者鉴定多倍体倍性的标准3.2核仁组织区数目法二倍体泥鳅具有两个核仁组织区，分别位于两套染色体组中的中部着丝粒染色体的1 号染色体上；三倍体泥鳅具有三个核仁组织区，分别位于三套染色体组中的中部着丝粒染 色体的1号染色体上；四倍体、五倍体、六倍体分别具有叫个、五个、六个核仁组织区， 分布于各套染色体组的相同染色体的相同位置上因此可以利用核仁组织区特殊显色的方 法确定核仁组织区的数目，如银染、cma3/da/dapi、荧光原位杂交等技术，从而确定相应 泥鳅个体的倍性无论细胞处于间期还是分裂期，核仁组织区均能被以上儿种染料不同程 度地着色银染法虽然简单便捷，但在银染过程中，只具有rRNA转录活性的核仁组织区 才能被银染，当采用此种方法时应根据银染点的众数判断倍性，而后两种核仁组织区显色 的原理与核仁组织区上的rRNA转录活性无关，这两种方法可准确地鉴定泥鳅多倍体的倍 性，但操作过程繁琐耗时3.3染色体计数及核型公式法二倍体泥鳅具有两套染色体组2n = 50,三倍体泥鳅具有三套染色体组3n = 75,四倍体 泥鳅具有四螢染色体组4n = 100,其他泥鳅多倍体的染色体组及数目依次类推。

利用泥鳅 血细胞培养或者PHA二次注射等方法制备体细胞染色体，统计染色体的众数，即是相应泥 鳅个体的染色体数，根据泥鳅个体染色体的众数能大概确定倍性如再选取分散均匀，形 态良好，数FI合适的染色体分裂相做核型分析，就能完企确定相应泥鳅个体的倍性此法 鉴定泥鳅多倍体是最准确的，但前提要制备良好的染色体分裂相此法的缺点也是操作繁 琐耗吋，不易制备良好的染色体分裂相3.4 DNA含量测量法细胞核中的DNA经特殊染料如PI、DAPI等染色后，其荧光强度与DMA的含量呈正相 关，根据此原理可用流式细胞仪间接测DNA的含量，从而确定倍性此方法鉴定多倍体具 有较高的准确率，操作简便迅速，但检测用的流式细胞仪较昂贵以上四种泥鳅倍性鉴定方法都有各自的缺点和优点，在鉴定泥鳅倍性的过程中应将其 中的两种或更多种结合起来使用，使泥鳅的倍性鉴定过程简单的前提卜提高鉴定结果的准 确率4泥鳅多倍体的生长发育的状况泥鳅多倍体的生长发育的状况主要讨以通过多倍体的存活力、性腺发育状况以及生长 速度等方面研究。