生物化学：第十章核酸的生物合成.ppt

第十章 核酸的生物合成,基 因 (gene)： 为蛋白质或RNA编码的DNA功能片段，是以碱基排列顺序的方式储存的遗传信息 基 因 组（genome)： 某一物种拥有的全部遗传物质，从分子意义上说，是指全部DNA序列转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录,* 中心法则(the central dogma),转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录,转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录,转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录,转录 翻译 复制 DNA RNA 蛋白质 逆转录,主要内容 DNA的生物合成 复制 RNA的生物合成 转录 蛋白质的生物合成 翻译 基因重组与基因工程,第一节 DNA的生物合成 DNA Biosynthesis,一、DNA的复制 二、逆转录 三、 DNA的损伤和修复 四、多聚酶链式反应（PCR）,一、DNA的复制,DNA分子是如何通过复制把遗传信息高度保真性地（fidelity）传递给子代细胞的？,一、DNA的复制,概念：DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。

一）复制的基本规律,1、半保留复制,DNA半保留复制示意图,Watson 和Crick于1953 年假定DNA的复制为半保留复制全保留式 半保留式 混合式,DNA复制的三种可能方式,1958 年M. Meselson 和F. M. Stall 利用同位素15N标记大肠杆菌，首先证明了DNA半保留复制15N-15N,14N-14N,15N-14N,半保留复制的生物学意义,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点(origin) 在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个2. 有一定的复制起始点,放射自显影证实亲代链解开后立即进行复制，没有发现单链DNA细菌和酵母菌中DNA复制起始点的碱基序列,习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间的距离（或DNA片段）定为一个复制子(replicon) 复制子是独立完成复制的功能单位 DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。

3、复制方式,E.coil基因结构与复制起点,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),DNA的双向复制示意图,DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须是35 由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时，子代链的聚合方向也是不同的4、半不连续复制,领头链 (leading strand),随从链 (lagging strand),DNA的半不连续复制,半不连续复制动画,冈崎片段： 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段 原核生物: 10002000个核苷酸 真核生物: 100200个核苷酸,以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为领头链(leading strand) 以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为随从链(lagging strand)。

领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性二） DNA复制的体系 底物: dNTP (dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP) 聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol) 模板: 解开成单链的DNA母链 引物: 提供3-OH末端的寡核苷酸 其他酶和蛋白质因子: 拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶,复制的化学反应,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,聚合反应的特点,以DNA单链为模板 以dDNA为原料 引物提供3OH 聚合方向为5 3,1、拓扑异构E（动画）,DNA复制过程中正超螺旋的形成,解链过程中正超螺旋的形成,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象拓扑异构酶的作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,拓扑异构E,拓扑异构酶的作用,拓扑异构酶的作用,通过催化DNA拓扑结构的变化，减少由于解链形成的张力,解链,双螺旋存在张力,DNA拓扑异构酶,张力解除,双螺旋变成松弛状态,解螺旋酶(helicase)又称解链酶或rep蛋白 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。

每解开一对碱基，需消耗2分子ATP2. 解旋酶,3、单链DNA结合蛋白 (SSB ), 保护单链DNA 免遭核酸的降解 防止单链再次形成双链 降低DNA 的Tm，促进DNA 解链SSB,4、引发酶和引发体,引物酶是一种依赖DNA的RNA聚合酶，该酶以DNA为模板，合成一段RNA引物，为DNA聚合酶提供自由的3-OH，使子代DNA链能够开始聚合引物,引物酶,含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体引发体的组装形成,引物酶的作用：为DNA聚合酶提供自由的3OH RNA引物的大小，在原核生物中通常为50 100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对5、DNA 聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 ( DNA-dependent DNA polymerase, DDDP ) 简称：DNA-pol 活性：1. 53 的聚合酶活性 2. 核酸外切酶活性 大肠杆菌中至少有5 种，分别命为DNA 聚合酶、 DNA 聚合酶I（单体酶：单肽链） 主要功能：负责DNA 的损伤修复及在DNA 复制中切除引物，填补空隙的作用。

若用枯草杆菌蛋白酶处理此酶，可得两个片段蛋白酶切口,Klenow片段的分子结构,大片段保留了两种酶活性,即53聚合酶和35外切酶活性，通常被称为Klenow fragment5 3 聚合酶活性,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段能辨认错配的碱基对，并将其水解DNA聚合酶的核酸外切酶活性,35外切酶活力,DNA 聚合酶I小结,DNA 聚合酶（单体酶） 主要功能参于DNA 的损伤修复，具有53 聚合活力，较弱，3 5外切活性但无5 3外切活性 DNA 聚合酶 （寡聚酶） 是催化大肠杆菌DNA 复制的主酶，全酶有10 种亚基，含Zn2+大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能,延长因子,DNA聚合酶异二聚体,核心酶,校对,引物的结合和识别,促使核心酶二聚化,原核生物 DNA聚合酶,真核 DNA聚合酶,聚合酶,DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链6、DNA连接酶,功能 连接复制过程形成的DNA片段,形成一个3,5-磷酸二酯键,连接酶,连接酶,DNA连接酶的连接作用,连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板链,模板链,DNA连接酶催化的条件是： 需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基； 未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的； 需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。

DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用 是基因工程的重要工具酶之一DNA连接酶的作用,DNA复制酶系总览,（三）原核生物DNA 复制,以四种dNTP 为底物在DNA 模板指令下，按碱基配对的原则，由DNA 聚合酶催化，向DNA 的3OH 端添加核苷酸，以5 3 的方向合成与模板互补的新链1、复制的起始,原核生物：特定位点开始，特定位点终止，只有 一个复制子基因组能独立进行复 制的单位） 真核生物：多个位点起始，多复制子 大肠杆菌复制起始点：oriC （original） 终止点：ter （terminate）,一些特殊的Pr 可以识别并结合到复制起点，随即使DNA 双螺旋局部解链，形成复制眼，在其两端的DNA 的两股链呈丫字状，称为复制叉分别向两侧进行复制，通常复制叉双向等速前进，,迅速生长的细菌，第一轮复制未完成就启动第二次复制DNA复制的起始阶段，由下列两步构成 1解旋解链，形成复制叉： 由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA 单链DNA结合蛋白（SSB）四聚体结合在两条单链DNA上，形成复制叉。

2引发体组装和引物合成： 由解螺旋酶(DnaB蛋白) 、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域形成引发体； 在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,DNA复制的延长过程,2、DNA 链的合成与延伸,领头链的合成过程,随从链的合成过程,复制过程简图,DNA复制系统,SSP,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合E.coli,ori,ter,82,32,ori,ter,SV40,50,0,3、复制的终止,在复制过程中形成的RNA引物，需由RNA酶来水解去除； RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口1）去除引物，填补缺口：,在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链2）连接冈崎片段,随从链上不连续性片段的连接,拓扑异构酶将两个子代DNA环分离,为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。

DNA复制时的保真性主要与下列因素有关： 1遵守严格的碱基配对规律； 2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择； 3对复制过程中出现的错误及时进行校正DNA复制的保真性(fidelity)：,DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现外切酶活性四）真核生物DNA 复制,真核细胞染色体DNA 分子为线性的比原核细胞DNA 分子大，复制更为复杂 为多复制子复制（多起点双向复制），在全部染色体复制完成前，各复制子不能再开始新一轮复制真核生物DNA复制起始复合物的组装和激活分属于不同的细胞周期端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状真核生物端粒的形成：,在DNA 复制的同时另外还要组装成核小体线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应端粒酶(telomerase),端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。

端粒酶的分子结构,端粒酶RNA (human tel。