蛋白质分离纯化及鉴定综合实验.doc

1蛋白质分离纯化及鉴定综合实验一、实验内容将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液用考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质浓度；将粗提液通过 Sephadex G-25 凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度；将蛋白粗提液和收集到的各组分进行 SDS—PAGE 分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果二、实验过程：1.蛋白质粗提液制备溶液配制：0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液（1）1000ml 0.1mol/L 磷酸氢二纳； 磷酸氢二纳溶于 800mL 蒸馏水中，定容至 1L；（2）250mL 2.蛋白质浓度测定（1）溶液配制1mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）标准溶液：5mg 牛血清白蛋白溶于 5ml 水中；考马斯亮蓝 G-250 蛋白试剂：称取 100mg 考马斯亮蓝 G250 溶于 50ml 90%的乙醇溶液中，加入 85%的磷酸 100mL，最后用蒸馏水定容到 1000mL，滤纸过滤，避光保存2）0~100ug/mL 标准曲线测定：取 6 支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各 2mL蛋白质浓度µg/ml0 20 40 60 80 1001mg/mL BSA 溶液（µl）0 40 80 120 160 200蒸馏水（µl） 2000 1960 1920 1880 1840 1800总体积（µl） 2000 2000 2000 2000 2000 2000测定各个浓度的标准溶液 595nm 吸光值（OD595）： 500uL 蛋白质溶液与2.5mL 考马斯亮蓝 G250 溶液混匀，用分光光度计测定 OD595，每个溶液 3 次重复测定。

以 OD595 值（3 次重复的平均值）为 X，蛋白浓度为 Y 做直线，得出标准曲线Y=aX+b，R= ？3）测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释 100 倍（2mL） ，取稀释液500uL 与 2.5mL 考马斯亮蓝 G250 溶液混匀，用分光光度计测定 OD595，以500uL 蒸馏水+2.5mL 考马斯亮蓝 G250 溶液混匀作为空白对照， 3 次重复测定，用平均值计算其浓度3、Sephadex G-25 凝胶层析柱进行分离（1）凝胶溶胀：将固体凝胶在一定量的沸水浴中溶胀 5h，溶胀后倾去上清液，加入一定量的蒸馏水搅拌，静置使凝胶下沉，倾去上清液，直至无细小颗粒为止2（2）装柱：蒸馏水冲洗柱子，留少量蒸馏水，打开活塞，将悬浮于水中的凝胶连续灌入柱中，直至凝胶沉淀至柱的 4/5 体积处3）平衡：用 10 倍于柱床体积的 0.1mol/L pH7.4 的磷酸缓冲液洗柱，是柱中的离子环境和样品中的一致4）上样：柱床表面液体正好达到凝胶表面，关闭活塞，将蛋白粗提液（留过 20uL 供电泳用）缓慢加到凝胶表面，注意不能把凝胶冲起来（5）收集：打开活塞，使样品流下，样品完全进入凝胶后，缓慢加入0.1mol/L pH7.4 的磷酸缓冲液（注意不能把凝胶冲起来）使样品继续流出，分部收集流出物，第一管收集 1mL，以后每管收集 200uL，共收集 6 管。

6）稀释 20 倍，测定每个组分的蛋白浓度，可只测定一个 OD595 值，计算各组分的蛋白浓度4.SDS—PAGE溶液配制：100ml 30%凝胶储液（arc/bis）：29.2g 丙烯酰胺和 0.8g 甲叉双丙烯酰胺溶于80ml 蒸馏水中，定容至 100ml，避光保存 （该溶液有神经毒性，避免接触皮肤） ；100mL 1.5M Tris-HCl 三（羟甲基）氨基甲烷，pH8.8 ：18.15gTris 碱溶于60mL 蒸馏水中，用 HCl 调 pH 至 8.8，定容至 100ml 蒸馏水中；100ml 0.5M Tris-HCl（缓冲液）,pH6.8：6gTris 碱溶于 60ml 蒸馏水中，用 HCl调 pH 值至 6.8，定容至 100ml 蒸馏水中；10ml 上样缓冲液：0.5ml ddH2O（重蒸水，经过两次蒸馏的水） + 2.5ml of 0.5M Tris-HCl, pH6.8 + 2ml 甘油 + 4ml 10% SDS（十二烷基硫酸钠）+77.1mg DTT（二硫苏糖醇）+1ml 0.05（W/V）溴酚蓝；600ml 5×电泳缓冲液（？） ：9g Tris 碱+43.2g 甘氨酸 +3gSDS，蒸馏水溶解定容至 600ml；1ml 10%过硫酸铵溶液（现用现配）：0.1g 过硫酸铵溶于 1ml 蒸馏水中。

1000ml 固定液：取 908ml 50%的甲醇和 92ml 冰乙酸混匀；500ml 染色液：0.25g 考马斯亮蓝 R（ G?） 250，加 500ml 固定液溶解，过滤后避光保存；1000ml 脱色液：取 75ml 冰乙酸和 50ml 甲醇，加蒸馏水定容至 1000ml凝胶制备7.5%分离胶（20ml）10%SDS 0.2mlddH2O 11.87ml10%的 AP（过硫酸铵溶液） 0.1mlTEMED（.四甲基乙二胺） 10µl30% arc/bis 5ml1.5M pH8.8 Tris-HCl 2.5ml 34%浓缩胶（ 10ml）ddH2O 6ml30% arc/bis 1.3ml0.5MpH6.8Tris-HCl 2.5ml10%SDS 0.1ml10%的 AP 0.05mlTEMED 5µl灌胶：将电泳板组装好，先灌分离胶至 2/3 处，水封，分离胶凝固后，吸去水，灌入浓缩胶至满，插入梳子，注意不要产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子。

样品准备：分子量 Marker、100µg 粗提液、100µg 分离组分与样品缓冲液混合（哪种，混合比例） ，煮沸 3min，作为电泳样品上样电泳装置安装：安好后在正负极分别加入稀释好的电极缓冲液上样：将处理好的样品分别加入样品孔中，记好加样顺序电泳：接好电泳仪，通电，先恒压 80V 电泳，溴酚蓝前沿到达分离胶界面时 ，加大电压至 120V 继续电泳，直到溴酚蓝前沿到达凝胶底部 ，结束电泳剥胶：拆开电泳装置，取出玻璃板，看清点样方向，从玻璃板的一角撬起，凝胶留在长板上，在右下角切角作标记 ，用固定液冲下凝胶固定：将凝胶放在大培养皿中，用固定液固定 1h；染色：倒去固定液，加入染色液，染色 1h，脱色：倒去染色液，加入脱色液进行脱色，直至看清条带凝胶拍照三、实验结果1、 各组分蛋白浓度2、 电泳结果四、 分析讨论分离效果如何？实验设计如何改进？45。