测定淀粉酶活力的方法.doc

实验五 激活剂、抑制剂、温度及 PH 对酶活性的影响一、 目的要求 通过实验加深对酶性质的认识，了解测定 a-淀粉酶活力的方法二、 实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质， 通常称为生物催化剂 酶催化的反应称为酶促反应 生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与 辅基，辅酶，金属离子有关等特点能提高酶活力的物质，称为激活剂激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机 离子和简单的有机化合物使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或 丧失的物质称为酶抑制剂氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂应注意的是激 活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的 抑制剂如氯化钠达到约 30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和 PH值称为某种酶作用时的最适温度和 PH值温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度 为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低同样，反应中某 一 PH 范围内酶活力可达最高，在最适 PH 的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。

食品级 a - 淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、 PH、对淀粉的水解程度， 以及产物的性质等均有差异 a -淀粉酶属水解酶， 作为生物催化剂可随机作 用于直链淀粉分子内部的 a -1,4 糖苷键， 迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖， 使 淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称 a -淀粉酶为液化淀粉酶a -淀粉酶不能水解淀粉支链的 a -1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和 a -1,6 键的寡糖本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的 糊精（少于 6 个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪 a -淀粉酶作用于淀粉基质的水 解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数三、 激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响（一） 试剂及材料1、 1: 30唾液淀粉酶配置 用蒸馏水漱口， 1min后收集唾液，以1: 30倍蒸馏水稀释2、 0.2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉0.2g，预加20mL蒸馏水调匀，然后倒入 80mL沸水中，继续煮沸至溶液透明，冷却后补水至 100mL。

3、 1%NaCI溶液 称取1.0 g氯化钠，加水溶解稀释至 100mL4、 1%CuSO4溶液 称取1.0 g硫酸铜，加水溶解稀释至 100mL5、 标准稀碘液 称取11g碘，22g碘化钾，置研钵中，加入适量的水研磨至碘完全溶解， 并加水稀释定容至 500mL吸取2mL上述碘液，加入 10 g碘化钾，用水稀释至 500 mL二） 仪器设备 电热恒温水浴锅三）操作方法取试管3根，编号后按下表配置实验样液试管0.2%可溶1%NaCl1%CuSO4蒸馏水混匀，放入1 : 30唾液淀粉酶序号性淀粉37 C水浴中12.0 mL1.0 mL//保温10min1.0 mL22.0 mL/1.0 mL/立即加入唾1.0 mL32.0 mL//1.0 mL液淀粉酶1.0 mL用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因四、温度与PH值对a -液化淀粉酶活力的影响（一）试剂与材料1、 2%可溶性淀粉溶液 称取可溶性淀粉2.0g （预先在105 C烘干），预加20mL蒸馏水调匀,然后倾入80mL沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至 100mL。

2、 PH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（1） 0.2 mol /mL Na 2HPO4 称取 35.60g Na2HPO4.2H2O，用水溶解定容至 100mL2） 使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的 PH值3、供试酶液的制备 称取固体a -液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液100mL （缓冲液的加入量视酶活力大小而定，控制酶解反应在 5-10min内完成），于40C恒温水浴中活化 0.5小时，然后用3000rpm / min离心机离心分离 5min，酶提取液于冰箱保存， 供试验用4、 标准比色液甲液：称取氯化钴（C0CL6H20）40.2439g、干燥重铬酸钾0.4748 g,溶解并定容至 500mL 乙液：称取铬黑 T 40.00mg，溶解并定容至100mL使用时取甲液40.0mL、乙液5.0 mL，混合混合比色液宜放置冰箱保存，使用 7天后重新配置5、 标准稀碘液二） 仪器设备 电热恒温水浴锅三） 操作方法1、 用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中， 作为判断酶解反应终点的标准色2、 不同温度对a -液化淀粉酶活力的影响取4根①25 x 200mm试管，按下表配制反应溶液。

试管序号12342%可溶性淀粉20.0mL20.0mL20.0mL20.0mLPH6.0缓冲液5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL把四根试管分别放入 50C、60C、70C、80C恒温水浴中预热 10min分别加供试酶液0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL反应完成时间记50 C60 C70 C80 C录（min）加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取1-2滴反应液，滴入预先盛有 2/3稀碘液的比色白瓷板孔穴内 ，从淀粉遇碘显色的变化情况,跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色 液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间3 、不同PH值对a-液化淀粉酶活力的影响取5根①25 X 200mm试管，按下表配制反应溶液试管序号2%可溶性淀粉缓冲溶液供试酶液反应完成时间记录（min）120mLPH4.0 5.0 mL恒温水0.5 mL320mLPH6.0 5.0 mL浴60C0.5 mL420mLPH7.0 5.0 mL预热0.5 mL520mLPH8.0 5.0 mL10min0.5 mL其它操作与温度对酶活力影响实验相同。

五、结果计算和讨论淀粉酶活力单位定义为 在一定条件下，1 g酶制剂1小时内液化可溶性淀粉的克数酶活力单位（U/g）= 60 20 0.02 — n t 0.5式中：20――可溶性淀粉的用量（ml）;t 酶解反应完成所需的时间（min）；0.5 测定时稀释酶液用量（ml）;0.02 ――可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL）；n ――酶制剂稀释倍数1、不同温度对 a -液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果50 C60 C70 C80 C酶活力（U/g）2、不同pH值对a -液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果pH4.0pH6.0pH7.0pH8.0酶活力（U/g）分别以PH值、温度为横坐标，以酶活力单位为纵坐标，绘制 PH值一酶活力单位、温度一酶活力单位图讨论分析实验结果六、思考题1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？2、 实验过程中若激活剂或抑制剂的作用不明显，如何调整实验方案？3、 进行酶的生化实验必须考虑控制哪些条件？为什么？4、 生化反应用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？5、 酶在干燥状态下与在水溶液中保存，它的活性受温度的影响是否相同？。