HPLC方法测胆汁酸含量方法汇总.docx

HPLC方法测胆汁酸含量方法汇总一、 反相高效液相色谱法测定鼠胆汁中游离与结合型胆汁酸(一) 试验仪器Ardent LC-1100高效液相色谱仪，附荧光检测器(A gilent公司，美国);Waters Nova C18色谱柱( 3.9 X 150 mm, 5l.μm) ( Waters公司美国)，保护柱及C18柱芯(Phenomenmex公司美国)；Chromabond C18固相萃取小柱(M acherey- Nagel)公司德国)二) 试验试剂4-嗅甲基-7-甲氧香豆素(BM C)、18-冠醚-6(DCC)，α-鼠胆酸(α-MCA) ,β-鼠胆酸(β-M CA)、熊脱氧胆酸(U DCA)、胆酸(CA)、猪脱氧胆酸(H DCA )、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)标准品及胆酞甘氨酸水解酶均购自美国sig m a公司甲醇、乙睛(色谱纯，美国天地公司)，月桂酸(分析纯，上海化学试剂公司)，氢氧化钾、磷酸二氢钾(分析纯，成都化学试剂厂).(三) 色谱条件流动相:A相，甲醇:乙睛为1:2(V/V)；B相，超纯水；梯度洗脱程序:65%A (0~8min)，80% A(8~16 min)，90% A(16~20 min)；柱温：20℃；流速:1 mL/ min;激发波长:330nm；发射波长：400nm。

四) 样品处理 样品预处理:取鼠胆汁20μL，加入120μmol/ L月桂酸甲醇液50μL，再加入乙睛2 mL，充分混匀，超声20 min, 10 000 g离心10 min，取上清液，在60℃氮气下吹干 胆汁酸的提取:测定游离与甘氨结合型胆汁酸时，将预处理吹干后的胆汁样品溶于2 mL 0.5mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7)，加至已活化的固相萃取C18小柱上(用2 mL甲醇和5 mL蒸馏水依次活化C18小柱)，再用10 mL蒸馏水淋洗小柱，最后用3mL甲醇洗脱胆汁酸.测定牛磺结合型胆汁酸时，向预处理吹干后的胆汁样品中加入1 mg胆酞甘氨酸水解酶，再加入0. 025 mol/ L的磷酸钾缓冲液(pH 5.6) 0.5 mL,避光37℃反应30 min，再加入O.5 mol/ L磷酸盐缓冲液(pH 7) 2 mL终止反应.然后加至已活化的固相萃取C18小柱上，其余步骤同测定游离与甘氨结合型胆汁酸. 胆汁酸的衍生与测定:向胆汁酸洗脱液中加入150 μL 1. 8 mmol/ L KOH甲醇液于60 ℃氮气下吹干，然后加入10 mmol/ L BM C乙睛液与5 mmol/ LDCC乙睛液各50μL，密闭，37℃条件下反应30min，取10μL进样分析.二、 高效液相色谱滓联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆酸(一) 试验仪器 AP I 2000质谱仪(加拿大A pplied Biosystens公司)，配备Perk in E Inmer 200泵和tubro离子源;A tlantisdC18色谱柱，150 mm X 3.9 mm, 5μm(美国Waters公司)，保护柱及C18柱芯(美国Phenan enex公司)，请预览后下载！Chrcm abond C18 ec ( 3 mL /200 m g德国M achere-N agel公司)，M illpore纯水装置(美国M illpore公司)。

15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱纯(Sigma公司);甲醇、乙睛和甲酸均为色谱纯(美国Tedia公司)二) 试验试剂15种胆汁酸标准品和醋酸按均为色谱纯(Sigma公司);甲醇、乙睛和甲酸均为色谱纯(美国Tedia公司)三) 色谱条件柱温:25℃；流速:1 m L /min分流比为1:4；流动相A: 5 mm o 1/L醋酸铵和0.O1%甲酸水溶液；B: 5 mm o 1/L醋酸铵和0 O1%甲酸甲醇溶液梯度洗脱程序为:Omin（80% B)à9min(97.0% B) à10 m in ( 80% B) à15 m in ( 80 % B )四) 样品处理蛋白沉淀法：800 μL乙睛中加入300 μL血清，混匀1 min,超声30min以15000 X g离心15min,取900μL上清液60℃氮气吹干，其余同固相萃取固相萃取法：依次用1 mL甲醇,1mL0.05%甲酸溶液活化固相萃取小柱1 mL 0.05%甲酸溶液中加入300μL血清，混匀1 min后上小柱依次用1 m L 0.05%甲酸溶液、1 mL甲醇水溶液( 45: 55, V /V)冲洗在重力作用下滴干后，真空抽干再用L 5 mL甲醇洗脱，洗脱液在600C氮气吹干，残余物溶于100 μL流动相(A: B= 20: 80，V/V)中，漩涡混匀lmin超声2min。

取20 μL进行H PLC-MSIMS分析，检测时间15min三、 高效液相色谱法同时测定胆汁中9种结合型胆汁酸(一) 试验仪器Shimadzu 2010LC- AHT高效液相色谱仪，附紫外检测器(日本Shimadzu公司);Aglient固相萃取装置(美国Aglient公司);Millipore纯水装置(美国Millipore公司)；Chromabond C18固相萃取小柱(德国Maeherey- Nagel公司)；牛磺熊脱氧胆酸CTauroursodeoxycholic acid TUDCA)、牛磺胆酸(CTaurocholic acid TCA)、甘氨胆酸(Glycocholic acid,GCA)、甘氨石胆酸(Glycol-ithochdic acid, GLCA)、甘氨脱氧胆酸(Glycodeoxycholic acid,GDCA)牛磺脱氧胆酸(CTaurodeoxycholic acid TDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(Glycochenodeoxycholic acid GCDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸门，aurochenodeoxycholic acid, TCDCA)、牛磺石胆酸CTaurolithocholic acid TLCA)标准品均购自美国sigma公司;甲醇、乙睛(色谱纯，美国Tedia公司)，其余试剂均为分析纯。

二) 试验试剂牛磺熊脱氧胆酸CTauroursodeoxycholic acid TUDCA)、牛磺胆酸(CTaurocholic acid TCA)、甘氨胆酸(Glycocholic acid,GCA)、甘氨石胆酸(Glycol-ithochdic acid, GLCA)、甘氨脱氧胆酸(Glycodeoxycholic acid,GDCA)牛磺脱氧胆酸(CTaurodeoxycholic acid TDCA)请预览后下载！、甘氨鹅脱氧胆酸(Glycochenodeoxycholic acid GCDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸门，aurochenodeoxycholic acid, TCDCA)、牛磺石胆酸CTaurolithocholic acid TLCA)标准品均购自美国sigma公司;甲醇、乙睛(色谱纯，美国Tedia公司)，其余试剂均为分析纯三) 色谱条件谱柱为Waters Nova C18柱(3.9 mm x 150mm, 5μm)，流动相为甲醇一60 mmol/L磷酸盐缓冲液(66:34,v/v) ,pH 3.3，等度洗脱，柱温25℃，流速：0.8 ml/min;检测波长:197 nm，进样量为10 μL。

四) 样品处理方法1:取胆汁样品25μL，加入乙睛2.5 ml，旋涡震荡混匀，超声20 min,10 000g/min离心10min，取上清液2 ml, 60℃氮气下吹干将预处理吹干后的汁样品溶于2 ml 0.5 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，加至己活化的固相萃取C18小柱上(预先用2 ml甲醇和5 ml蒸馏水依次活化C18小柱)，再用10 ml蒸馏水淋洗小柱，最后用3 ml甲醇洗脱胆汁酸洗脱液在60℃氮气下吹干后溶于200μL流动相，超声30 s,lOμL 进样四、 血清中胆汁酸的高效液相色谱荧光测定及质谱鉴定(一) 试验仪器 1100型高效液相色谱-质谱联用仪(Agilen t公司)，配备四元梯度泵，100位自动进样器，荧光检测器，真空脱气机，大气压化学电离源(APCI); H ypersil C18色谱柱(4.6 mm X 200 mm, 5μm,中国科学院大连化学物理研究所)1, 2-::苯并-3,4-二氢咔唑一9-乙基对甲苯磺酸酯(自制);胆汁酸标准样品(Sigma公司);无水乙睛(禹城化学试剂厂)，用P2O5干燥后蒸馏处理，二甲基亚矾经减压蒸馏后备用;柠檬酸钾、酒石酸钠等均为分析纯，实验用水由M illi-Q超纯水系统制备。

二) 试验试剂标准溶液的配制：准确称取定量胆汁酸标准品，用乙睛配成0.001mol/L的溶液称取208.5 m g的1, 2-:苯并-3,4二氢咔唑一9-乙基对甲苯磺酸酯( BDETS)用二甲基亚矾定容至l Om L,浓度为0.05 mo1/L相应低浓度的衍生试剂(500μmol/L)标准溶液用二甲基亚矾稀释，低浓度胆汁酸(50μmol/L)标准溶液用无水乙睛稀释而成三) 色谱条件色谱柱:H ypersil C18色谱柱(4.6 mm X 200 mm, 5μm )流动A: 50%乙睛水溶液(含有40 mm o 1/L的HCOONH4, pH = 3.5); B: 100%的乙睛梯度洗脱程序为(0%B 35 min线性梯度到70%B到40 min线性梯度到10(plo B, 100%B再运行15min流速为1.0mL/min柱温300℃荧光激发波长和发射波长分别为: λex = 333 nm, λem=390 nm.请预览后下载！质谱条件:1100型高效液相色谱领谱联用仪;大气压化学电离源(APC I)，正离子模式，喷雾压力0.42 M Pa;干燥气流量为5 L /min燥气温度350℃，气化温度450℃;毛细管电压3500V，电晕电流4000nA(四) 样品处理标准品的衍生过程：盛有500 m g柠檬酸钾催化剂的安培瓶中依次加入100 mL DM S0, 50 μL混合胆汁酸溶液，150 μL衍生试剂溶液，封口后于95℃恒温水浴下振荡反应30min取出放冷后加入300 μL乙睛混合均匀，取上层溶液用乙睛水溶液(CH3CN /H20, 1:1, V/V)稀释5倍直接进样分析。

血清中胆汁酸的提取：向盛有2 mL血清样品的离心试管中加入3 mL甲醇并振荡摇匀，然后加入0.5g硫酸按固体超声振荡，离心后取出有机相用氮气吹干，剩余物用300 mL DM SO溶解后加入6.7 mL水然后用经过4m L甲醇和5m L水冲洗的C18 Sep-Pak萃取柱过滤，再用5 mL水冲洗萃取柱，然后用5 mL乙睛将胆汁酸洗脱，将洗脱液挥发至干用300 mL DMSO溶解冷藏备用五、 柱前衍生反相高效液相色谱法测定血清中9种胆汁酸(一) 试验仪器LC-6A高效液相色谱仪，RF-535荧光检测器(日本，岛津公司);玻璃管均硅烷化二) 试验试剂 胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、熊脱氧胆酸(U DCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸( GCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨石胆酸(GLCA) ( Sigma aldrich公司)BM C(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素),DCC(18-冠醚-6) ( Sigma aldrich公司)，甲醇、乙睛(色谱纯，美国天地公司)，氢氧化钾、磷酸二氢钾、月桂酸均为国产分析纯三) 色谱条件Wate。