TLC技术原理与应用.doc

TLC（薄层层析色谱）技术原理与应用一、薄层层析（ TLC ）简介薄层层析是将吸附剂或者支持剂 （有时加入固化剂） 均匀地铺在一块玻璃上， 形成薄层把欲分离的样品点在薄层上， 然后用适宜的溶剂展开， 使混合物得以分离的方法 由于层析在薄层上进行故而得名薄层层析是一种微量、 快速的层析方法 它不仅可以用于纯物质的鉴定， 也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件根据分离的原理不同， 薄层层析可以分为两类： 用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶；用纤维素粉、 硅胶、 硅藻土为支持剂铺成的薄层，属于分配薄层层析吸附 TLC →固定相为吸附剂 →氧化铝、硅胶 （较多用）TLC →分配 TLC →固定相为液态（通常为水） → 固定相吸附在支持剂上一）吸附薄层的基本原理：吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同， 及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生吸附强度决定于吸附剂的吸附能力，还受被吸附成分的性质影响，更与展开剂的性质有关。

1.吸附薄层层析：在硅胶薄层板上，样品中的两成分是两种结构近似的染料，在展开剂四氯化碳的作用下 在展开剂和薄层板之间不断地产生吸附、 解吸，再吸附， 再解吸， 由于对氨基偶氮苯的极性比偶氮苯的极性稍强一些， 层析的结果， 对氨基偶氮苯受到的吸附作用稍强于偶氮苯，从而将两者分离展开结束以后，会在薄层板上形成两个斑点，混合物中的成分得以分离中药中的有效成分复杂多样， 结构近似者不少 特别是对未知结构的成分分析， 设计并摸索出合理的层析条件是首要任务 只有先设计出可用的层析条件， 再经摸索改进， 才可能对未知或者已知成分进行成功地分离然后才能谈得上进一步的分析研究要设计出合理有效的层析条件， 必须熟悉薄层层析条件的选择的基本要领 下面对薄层层析条件的选择做一初步介绍薄层层析的三项基本构成物质是：样品组分、吸附剂、展开剂摸索层析条件，实际上是协调上述三者的关系， 寻求一种能够有效分离样品组分的配合方案及实际操作要领 很明显，一切层析都是针对分析任务，也就是围绕待分离的样品组分来进行调整适应的可见，层析条件的选择是以样品中的各组分为中心，适当调适展开剂的吸附剂的极性来实现的二）薄层层析条件的选择：1.概述：吸附剂的选择： 薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。

主要区别在于薄层层析要求吸附剂（支持剂）的粒度更细，一般应小于 250 目，并要求粒度均匀用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高， 以Ⅱ～Ⅲ级为宜 而展开距离则随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细，展开距离相应缩短，一般不超过 10 厘米，否则可引起色谱扩散影响分离效果展开剂的选择：薄层层析，当吸附剂活度为一定值时（如Ⅱ或Ⅲ级） ，对多组分的样品能否获得满意的分离， 决定于展开剂的选择 中草药化学成分在脂溶性成分中， 大致可按其极性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性基本思路是根据待分离样品组分的极性来确定吸附剂的极性 （类型、 活化度） 和展开剂的极性（主要溶剂、调节溶剂、辅助溶剂等） 要协调、处理好吸附剂、展开剂、及被分离成分三者之间的关系，才能得到理想的薄层层析结果2.吸附剂：对吸附剂的基本要求是颗粒细致 (薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同主要区别在于薄层层析要求吸附剂 /支持剂的粒度更细，一般应小于 250 目，并要求粒度均匀 )、大小均匀（亦即有较大的表面积和适当的吸附活性） ；不能与样品组分、样品溶剂、展开剂发生化学反应；更不能与溶剂及展开剂发生溶解 （注：实际操作中，可通过选择不同的活化温度对吸附剂活性进行调节） 。

用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高， 以Ⅱ～Ⅲ级为宜 而展开距离则随薄层的粒度粗细而定， 薄层粒度越细， 展开距离相应缩短， 一般不超过 10厘米，否则可引起色谱扩散影响分离效果最常用的吸附剂是＿＿＿和＿＿＿＿另外，市场上还有氧化镁、硅酸镁、碳酸镁、硅藻土、活性炭等其中，只有活性炭是非极性吸附剂，其余均是极性吸附剂它们对水和极性大的化合物吸附能力强1） 氧化铝：化学式为 Al2O3 ，国产层析用氧化铝有碱性、中性、酸性三种，以中性氧化铝应用较广氧化铝的特点：A: 氧化铝为吸附力较强的极性吸附剂， 它适用于中性或者碱性的亲脂性化合物的分离通常氧化铝的吸附能力与其自身的含水量有关含水越多，吸附活性越小，吸附能力越小氧化铝根据其含水量多少将其活性划分为五级B: 氧化铝的吸附能力与其自身的含水量有关（ 2） 硅胶：表达式为 SiO2?XH2O 层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－ Si － OH ），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附特点：A：硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关如对有机酸、挥发油、萜类、皂苷、黄酮、蒽醌、氨基酸等成分的分离适用，不能用于生物碱等碱性物质的分离。

B：硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离由于结构的决定作用，氧化铝的活化温度可以很高（ 150 ℃－ 160 ℃），而硅胶的活化温度却不能太高（ 105 ℃－ 110℃）一旦超过 500 ℃，硅醇基会相互脱水而失活C：硅胶的活化温度通常为 105 ℃－ 110 ℃，不能过高根据样品的酸碱性和极性大小确定了吸附剂以后， 正确选择展开剂也是保证层析较好的分离的重要条件3. 展开剂：展开剂：薄层层析中用来将样品展开的溶剂展开：用极性适当的溶剂浸润已经点了样品的薄层板一端， 凭借毛细作用带动样品在薄层板上移动，最终使样品分离的操作过程展开剂常是由两种或者两种以上的溶剂铵一定的比例组成的溶剂系统所用的溶剂 “展开剂 ”＝ “溶剂系统 ”＝ “溶剂 ”；“展开 ”＝ “展开过程 ”简称溶剂系统或展开4. 被分离成分：被分离成分：分析任务所要完成分离的样品中的有效成分被分离成分的极性决定于其母核结构类型及官能团极性 如果吸附剂活性和展开剂活性固定不变的条件下， 被分离成分的极性越大， 吸附剂对其作用越强，展开距离越短；被分离成分极性越弱，吸附剂对其作用越大，展开距离越大。

一些基团的极性相对大小顺序已经在课本 P31 列出当然，具体物质的极性大小判断时，还要结合分子结构的具体情况进行判断总之，选择层析条件时， 必须针样品中对被分离成分的极性， 试行判断或确定吸附剂种类和活性，再探索配制展开剂在选择层析条件时，必须根据样品、展开剂、被分离物质三方面缩合考虑历史上吸附层析出现最早， 是由俄国生物学家茨维特用碳酸钙作为固定相， 石油醚作为流动相来分离植物色素的 除了吸附层析之外， 另一经典的层析法是以液体作为固定相的液相层析液体固定相（多为水）被吸附在固态载体物质上，这些载体物质多是一种多孔性物质这些液态固定相被载体固定在柱中，就成为液－液分配柱层析三）分配薄层层析：用极性溶剂吸苷在固体支持剂上所形成的混合物， 铺成薄层 （或装柱），然后活化、 点样（或上样），再用极性较弱的展开剂（或洗脱剂）进行展开分配层析的一般原理： 在展开过程中， 各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配，由于各成分在两相间的分配系数不同，因而可以达到相互分离的目的以 CS 表示某成分在固定相中的浓度， Cm 表示某成分在固定相中的浓度则分配系数： K＝ CS/Cm载体应该具备的基本条件：中性、多孔粉末、无吸附活性、在洗脱剂之中不溶解；所能够吸收固定相的量， 最好能达载体本身重量的 50% 以上；能使流动相自由的通过载体所吸收的固定相， 并且不改变溶剂系统的组成。

能够满足这些条件的载体是硅胶、 硅藻土、纤维素粉等分配层析所用的固定相一般为水及各种水溶液（酸、碱、盐与缓冲液） 、甲酰胺、低级醇（亲水性）等分配层析所用的流动相选用与水不溶 （或微溶） 的有机溶剂 如石油醚、 苯、卤代烷类、脂类、酮类（如丁酮） 、醇类（丁醇、戊醇）等或者它们的混合物分配层析对混合物中各成分的分离， 主要决定于各成分分配系数的差异， 一般说来， 对于种类成分均能适用， 特别能适用于水溶性、 亲水性物质而又稍能溶于有机溶剂中者 这样就恰好弥补了一般吸附层析（如氧化铝吸附层析适用于亲脂性物质）的不足但是，由于分配柱层析样品处理量较少， 因此，如能用吸附柱层析解决问题时， 常优先使用氧化铝或硅胶吸附柱层析一般分配层析的条件可以由 PC 来摸索，再应用于分配柱层析四） 薄层的制备：1．基板的规格和构成： 5×15㎝、 5×20 ㎝、 10 ×10 ㎝、 20×20㎝大小的玻璃板或者不锈钢板、塑料板2．薄层板的分类：软板（制板时不加粘合剂） 、硬板（制板时加入粘合剂） 3．软板的制备：详见 P32 4．硬板的制备：详细演示、介绍手工铺板，了解薄层涂铺器的使用方法五） 薄层层析的操作步骤：1．点样：A: 样品的溶解：将样品溶于展开剂极性相近、挥发性高的有机溶剂。

B: 薄层点样：用毛细管（ 0.5mm 以下）或用专业点样器进行点样点样的要求：样点位置应在距离底边 1-1.5cm 处；点样量适当；样点直径小于 2-3mm ；间隔反复点样；多个样点时，间隔为 2cm 且处于同一条直线上经验做法：可先在 PC 或 TLC 点上不同量的样品，并展开、显色后观察分离情况，以此确定最佳样品用量。