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现代实验动物学技术现代实验动物学技术现代实验动物学一、转基因动物一、转基因动物Ø转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究中的突出成果中的突出成果Ø近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究等多方面做出了很大的贡献等多方面做出了很大的贡献 现代实验动物学（一）转基因动物的概念（一）转基因动物的概念 转基因动物（转基因动物（transgenic animal）是指以实验方法导入的）是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物Ø外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞中并遗传给后代，这种外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞中并遗传给后代，这种动物叫转基因动物动物叫转基因动物Ø严格说，转基因动物有别于嵌合体严格说，转基因动物有别于嵌合体Ø嵌合体动物（嵌合体动物（chimeric animal）：）：只有部分组织细胞的基因组只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因。

中整合有外源基因 逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制备的动物第一代均为嵌合体雄原核显微注射法制备的动物第备的动物第一代均为嵌合体雄原核显微注射法制备的动物第一代中一代中1-10%为嵌合体（延迟整合）为嵌合体（延迟整合）现代实验动物学¹Gordon等人首次成功地将含有等人首次成功地将含有HSV和和SV40DNA片段片段的重组质粒的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源核内，得到了带有这种外源DNA顺序顺序TGM¹1982年年Palmiter等运用此法得到的所谓等运用此法得到的所谓“超级巨鼠超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动曾引起整个生物学界的轰动¹到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等等大小动物牛等等大小动物¹从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传、肿瘤从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传、肿瘤学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的开发研究等基因治疗的开发研究等。

现代实验动物学（二）转基因动物的制作方法（二）转基因动物的制作方法1、受精卵雄原核显微注射法、受精卵雄原核显微注射法2、胚胎干细胞（、胚胎干细胞（ES细胞）法细胞）法3、逆转录病毒感染法、逆转录病毒感染法4、体细胞核移植法、体细胞核移植法5、精子载体法、精子载体法6、、YAC法法现代实验动物学1、雄原核显微注射法、雄原核显微注射法¹以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体续发育获得转基因动物个体 ¹目前应用较广泛，最早最经典的方法目前应用较广泛，最早最经典的方法现代实验动物学这一方法的实验程序如下：这一方法的实验程序如下：（（1）准备假孕母鼠（养母））准备假孕母鼠（养母）（（2）受精卵的准备）受精卵的准备（（3）基因导入）基因导入（（4）胚胎移植）胚胎移植（（5）对幼鼠的鉴定）对幼鼠的鉴定现代实验动物学Timing of Pre-Implantation events现代实验动物学现代实验动物学Oviduct Transfers现代实验动物学Expression of Exogenous Genes现代实验动物学Screening Strategies¹Southerns,¹Induction/Loss of Restriction sites,¹PCR¹RT-PCR¹测定表达产物活性：测定表达产物活性：ELISA，，RIA¹其成功率的高低主要取决于受精卵和胚胎发育的时间。

其成功率的高低主要取决于受精卵和胚胎发育的时间¹基因的整合是随机的，多数插入单一染色体位点中基因的整合是随机的，多数插入单一染色体位点中外源基因的插入会引起宿主基因的外源基因的插入会引起宿主基因的DNA序列重排，序列重排，缺失，重复或易位缺失，重复或易位现代实验动物学¹外源基因也可不插入呈游离状态，以质粒形式存在外源基因也可不插入呈游离状态，以质粒形式存在表达功能并传给子代，其详细机理现在也不是很清表达功能并传给子代，其详细机理现在也不是很清楚优点：优点：¹外源外源DNA大小基本不受限制（大小基本不受限制（1-50kb）；）；导入过程导入过程直观；直观；¹整合率高整合率高缺点：缺点：¹设备昂贵、环节较多设备昂贵、环节较多¹对操作人员有较高的技术要求　对操作人员有较高的技术要求　¹低效率（尤其是大家畜）低效率（尤其是大家畜）¹对卵子伤害大，胚胎存活率低对卵子伤害大，胚胎存活率低¹基因整合随机性基因整合随机性¹转基因沉默转基因沉默现代实验动物学2、胚胎干细胞（、胚胎干细胞（ES细胞）法细胞）法¹ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。

能细胞系¹将携带有外源基因的将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物生嵌合体及转基因动物¹它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态下表现出不同的功能状态在在ES细胞上的基因操作：细胞上的基因操作： 可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞因此，借用因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代某种基因功能的动物后代现代实验动物学Generating ES Cells现代实验动物学Screening ES Cell Clones现代实验动物学现代实验动物学Retrieval of Blastocysts现代实验动物学Injection of ES cells into blastocysts现代实验动物学现代实验动物学优点：优点：¹外源基因整合情况的可控性高。

外源基因整合情况的可控性高¹可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性达的水平及插入的稳定性¹外源基因导入外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便缺点：缺点：¹ES细胞系建立及培养困难细胞系建立及培养困难¹维持维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易细胞的未分化及多向分化潜能不易¹所得个体为嵌合体所得个体为嵌合体目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚动物上应用较晚现代实验动物学（三）转基因动物的特性（三）转基因动物的特性¹整整合合拷拷贝贝数数1-100左左右右，，多多拷拷贝贝常常以以首首尾尾相相连连接接的的形式存在形式存在¹整合是随机的整合是随机的¹整合是稳定的，可以传给子代整合是稳定的，可以传给子代¹外源基因可以在一种组织或多种组织中表达外源基因可以在一种组织或多种组织中表达¹少数外源基因两侧序列有重排现象少数外源基因两侧序列有重排现象¹基因表达强弱与拷贝数无关，与基因表达强弱与拷贝数无关，与“位置效应位置效应”有有关。

关现代实验动物学（四）转基因动物的意义（四）转基因动物的意义¹转基因动物是在单细胞基因转染技术的基础上发展起转基因动物是在单细胞基因转染技术的基础上发展起来的而许多基因的表达是无法通过转染的方法来研而许多基因的表达是无法通过转染的方法来研究：究：¹基因表达有时空与组织的特异性；基因表达有时空与组织的特异性；¹外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；因此，只有通过转基因的动物才有可能研究基因的表因此，只有通过转基因的动物才有可能研究基因的表达、调控及基因之间的相互作用达、调控及基因之间的相互作用¹进进行行功功能能基基因因组组学学的的研研究究，，研研究究外外源源基基因因在在动动物物整整体体水平的表现调控规律水平的表现调控规律¹转转基基因因动动物物疾疾病病模模型型可可用用来来进进行行疾疾病病发发病病学学和和治治疗疗性性研究¹也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要¹还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质现代实验动物学二、免疫缺陷动物二、免疫缺陷动物 （（Immunodeficient animal））（一）定义：（一）定义： 是是指指由由于于先先天天性性遗遗传传突突变变或或用用人人工工方方法法。

造造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物二）分类：（二）分类：1、先天性免疫缺陷动物：、先天性免疫缺陷动物： a. T淋巴细胞功能缺陷动物：裸小鼠，裸大鼠淋巴细胞功能缺陷动物：裸小鼠，裸大鼠 b. B淋巴细胞功能缺陷动物：淋巴细胞功能缺陷动物：CBA/N小鼠小鼠 c. NK细胞功能缺陷动物：细胞功能缺陷动物：Beige小鼠小鼠 d. 联合免疫缺陷动物：联合免疫缺陷动物：SCID小鼠等小鼠等2、获得性免疫缺陷动物：猴、小鼠、猫等、获得性免疫缺陷动物：猴、小鼠、猫等AIDS模型模型现代实验动物学（三）裸小鼠（（三）裸小鼠（Nude Mice））现代实验动物学1、发现与发展、发现与发展¹1962年年英英国国格格拉拉斯斯哥哥医医院院Grist在在非非近近交交系系的的小小鼠鼠中中偶然发现有个别小鼠无毛偶然发现有个别小鼠无毛¹1966年证实是由于第年证实是由于第11对染色体基因突变所致对染色体基因突变所致¹1968年，年，Pantelouris解剖发现裸鼠失去了正常的胸腺解剖发现裸鼠失去了正常的胸腺¹由于裸鼠原种抵抗力差，生育力低，寿命短，不能用由于裸鼠原种抵抗力差，生育力低，寿命短，不能用于实际。

和纯系于实际和纯系BALB/C，，C3H，，C57BL/6小鼠交配，小鼠交配，不断选育，获得了三种近交系鼠（不断选育，获得了三种近交系鼠（Inbred Nude Mice））新种¹1969年年Rygaard首先将人结肠腺癌移植裸小鼠获得成首先将人结肠腺癌移植裸小鼠获得成功 裸鼠自发现以来，广泛应用于肿瘤学、免疫学和病毒裸鼠自发现以来，广泛应用于肿瘤学、免疫学和病毒学等多个学科的研究学等多个学科的研究现代实验动物学2、生物学特点、生物学特点（（1）一般特点）一般特点¹纯纯合合子子突突变变裸裸鼠鼠（（nu/nu））主主要要表表现现为为无无毛毛以以及及胸胸腺腺缺陷杂合子小鼠（缺陷杂合子小鼠（nu/+）各方面表现正常各方面表现正常¹体重小于同龄普通鼠，发育缓慢体重小于同龄普通鼠，发育缓慢¹必须养育在必须养育在SPF环境中环境中 ¹繁繁殖殖方方式式：：一一般般采采用用隐隐性性纯纯合合子子雄雄性性与与杂杂合合子子雌雌鼠鼠交交配（配（♂nu/nu×♀nu/+）现代实验动物学（（2）解剖生理特点）解剖生理特点¹胸胸腺腺残残留留一一些些上上皮皮样样细细胞胞；；淋淋巴巴组组织织胸胸腺腺依依赖赖区区的的淋淋巴细胞消失；外周血淋巴细胞减少。

巴细胞消失；外周血淋巴细胞减少¹虽虽然然有有原原始始的的T细细胞胞，，但但缺缺乏乏成成熟熟的的T细细胞胞T细细胞胞的的辅辅助助，，抑抑制制及及杀杀伤伤功功能能不不全全在在混混合合淋淋巴巴细细胞胞反反应应中中无无有有丝丝分分裂裂反反应应，，对对刀刀豆豆素素A或或植植物物凝凝集集素素P无无促促分分裂裂原应答¹无接触敏感性，无移植排斥，无移植物无接触敏感性，无移植排斥，无移植物 抗宿主反应抗宿主反应¹B细胞数量正常但功能有缺陷，合成的免疫球蛋白主要细胞数量正常但功能有缺陷，合成的免疫球蛋白主要是是IgM，，只有少量只有少量IgG ¹粒细胞功能较低，粒细胞功能较低，NK细胞活性高细胞活性高现代实验动物学BALB/c-nu的胸腺的胸腺昆明小鼠的胸腺昆明小鼠的胸腺现代实验动物学 3、裸鼠的应用、裸鼠的应用裸鼠在肿瘤研究上的应用：裸鼠在肿瘤研究上的应用：制作人类肿瘤移植瘤模型制作人类肿瘤移植瘤模型人类肿瘤移植于动物的历史人类肿瘤移植于动物的历史¹免疫排斥问题免疫排斥问题¹眼前房，脑内，地鼠的颊囊等免疫逃避部位眼前房，脑内，地鼠的颊囊等免疫逃避部位¹免疫抑制剂、射线照射的使用免疫抑制剂、射线照射的使用¹裸鼠作为人类肿瘤受体裸鼠作为人类肿瘤受体现代实验动物学肿瘤移植瘤模型在肿瘤移植瘤模型在肿瘤基础研究肿瘤基础研究中的意义中的意义¹添加人为因子（致突变剂，癌基因，药物等）观察肿瘤添加人为因子（致突变剂，癌基因，药物等）观察肿瘤 病因及机理和治疗。

病因及机理和治疗¹建立肿瘤细胞株：提供大量肿瘤组织供分析建立肿瘤细胞株：提供大量肿瘤组织供分析¹诊断和预后：建立平行模型，明确诊断和诊断和预后：建立平行模型，明确诊断和 跟踪预后跟踪预后¹个体化疗有效试验：对于晚期和复发肿瘤有重要意义个体化疗有效试验：对于晚期和复发肿瘤有重要意义¹药物有效的标准：药物有效的标准：1.肿瘤不生长；肿瘤不生长；2.肿瘤生长缓慢；肿瘤生长缓慢；3.肿肿 瘤长出后又消失；瘤长出后又消失；4.肿瘤无转移；肿瘤无转移；5.动物寿命延长动物寿命延长现代实验动物学肿瘤移植瘤模型制作方法肿瘤移植瘤模型制作方法¹肿瘤组织块或肿瘤细胞皮下移植肿瘤组织块或肿瘤细胞皮下移植¹腹腔内或肾包膜下移植腹腔内或肾包膜下移植¹原位移植原位移植现代实验动物学移植瘤模型成功制作的影响因素：移植瘤模型成功制作的影响因素：¹肿瘤组织：肿瘤组织： 恶性程度：恶性和转移复发瘤成功率较高恶性程度：恶性和转移复发瘤成功率较高 种类：细胞系成功率种类：细胞系成功率>活检标本活检标本 来源：淋巴瘤、骨肿瘤等难获成功来源：淋巴瘤、骨肿瘤等难获成功 部位：肿瘤块的外周部接种易成活部位：肿瘤块的外周部接种易成活¹裸鼠：裸鼠： 遗传背景：胰腺癌接种遗传背景：胰腺癌接种BALB/c 成功，成功，NIH系失败系失败 性别：雌激素依赖性肿瘤接种雄鼠生长慢性别：雌激素依赖性肿瘤接种雄鼠生长慢 鼠龄：鼠龄：4-6周周 动物健康状态动物健康状态现代实验动物学¹接接种种部部位位：：原原位位移移植植成成功功率率高高，，移移植植肿肿瘤瘤与与人人类类原原发发瘤瘤相相似似。

有有些些肿肿瘤瘤需需要要接接种种在在特特定定的的部部位位（（对对雌雌激激素素依依赖赖的的人人乳乳腺腺癌癌MCF-7细细胞胞系系，，接接种种乳乳腺腺脂脂肪肪垫垫才才能能成活）¹其其他他：：环环境境：：细细菌菌病病毒毒可可以以影影响响NK细细胞胞活活性性；；接接种种时时间越早越好，注意无菌操作间越早越好，注意无菌操作2）裸鼠在医学其他领域的应用：）裸鼠在医学其他领域的应用：¹免免疫疫学学：：研研究究体体液液免免疫疫与与细细胞胞免免疫疫的的关关系系，，研研究究免免疫疫相关疾病相关疾病¹寄寄生生虫虫：：寄寄生生虫虫感感染染的的动动物物模模型型，，美美洲洲锥锥虫虫，，卡卡氏氏肺肺囊虫囊虫¹皮肤：鱼鳞病皮肤：鱼鳞病¹免疫缺陷模型：麻风，结核免疫缺陷模型：麻风，结核现代实验动物学 （四）严重联合免疫缺陷小鼠（四）严重联合免疫缺陷小鼠 （（Sever Combined Immunodeficient Mice, SCID mice））¹1983年年Bosma首次报告，来源于首次报告，来源于C.B-17小鼠¹由于第由于第16对染色体隐性基因突变，纯合突变导对染色体隐性基因突变，纯合突变导致淋巴细胞抗原受体基因致淋巴细胞抗原受体基因VDJ区域重排的重组区域重排的重组酶活性异常，基因重排时断裂无法正常连接，酶活性异常，基因重排时断裂无法正常连接，从而影响从而影响B、、T细胞的正常功能分化。

细胞的正常功能分化¹1988年我国医科院动物所从美国年我国医科院动物所从美国Jackson实验室实验室引进；引进；1992年我校从澳大利亚引进年我校从澳大利亚引进现代实验动物学 1、生物学特点：、生物学特点：¹外观体重与普通小鼠相同外观体重与普通小鼠相同¹繁殖特点：纯合子兄妹交配繁殖特点：纯合子兄妹交配¹对鼠肝炎，巴氏杆菌、卡氏肺囊虫极易感染，感染后对鼠肝炎，巴氏杆菌、卡氏肺囊虫极易感染，感染后易发病死亡必须养育在易发病死亡必须养育在SPF环境中，平均寿命环境中，平均寿命1年以年以上 2、组织解剖学特点：、组织解剖学特点：¹脾脾脏脏、、胸胸腺腺、、淋淋巴巴结结体体积积低低于于普普通通小小鼠鼠的的30%，，淋淋巴巴组组织织缺缺乏乏淋淋巴巴细细胞胞胸胸腺腺残残留留上上皮皮样样细细胞胞和和成成纤纤维维细细胞胞，，脾脾脏脏没没有有脾脾小小体体，，白白髓髓缺缺限限，，红红髓髓正正常常，，淋淋巴巴结由网状细胞构成结由网状细胞构成¹外外周周血血白白细细胞胞总总数数减减少少，，淋淋巴巴细细胞胞占占10～～20%，，非非淋淋巴巴性性造造血血细细胞胞如如粒粒细细胞胞，，巨巨噬噬细细胞胞正正常常，，NK、、LAK细胞正常。

细胞正常现代实验动物学3、免疫功能特点：、免疫功能特点：¹没没有有B、、T 阳阳性性标标志志细细胞胞，，对对外外来来抗抗原原无无细细胞胞和和体体液液免免疫疫NK、、LAK细细胞胞功功能能正正常常或或增增高高；；肥肥大大细细胞胞因因缺缺乏乏T细细胞胞因因子子而分化受阻而分化受阻¹约约2-23%的的SCID小小鼠鼠在在青青年年期期B、、T细细胞胞功功能能可可以以恢恢复复，，称称为为渗渗漏漏（（Leaky）），，此此时时仍仍带带有有SCID基基因因，，淋淋巴巴细细胞胞不不受受影影响响而发育成熟，原因不明，可以用血清学和组织学方法诊断而发育成熟，原因不明，可以用血清学和组织学方法诊断4、、SCID小鼠的应用小鼠的应用¹用用于于自自然然防防御御细细胞胞如如NK、、LAK、、巨巨噬噬细细胞胞、、粒粒细细胞胞，，及及免免疫疫辅辅助助细细胞胞的的分分化化和和功功能能研研究究，，也也可可以以研研究究这这些些细细胞胞与与输输入入的的B、、T细胞、淋巴因子的相互作用细胞、淋巴因子的相互作用¹能能接接受受人人类类造造血血组组织织的的移移植植，，是是淋淋巴巴细细胞胞分分化化功功能能的的活活体体测测试试系统，可以用于评价人各类淋巴细胞的抗肿瘤活性。

系统，可以用于评价人各类淋巴细胞的抗肿瘤活性¹肿瘤接种成活率比裸鼠高何杰金氏淋巴瘤，白血病模型肿瘤接种成活率比裸鼠高何杰金氏淋巴瘤，白血病模型¹寄生虫：人血丝虫病寄生虫：人血丝虫病现代实验动物学。