实验三_硝酸还原酶活性测定.ppt

实验3 硝酸盐和光诱导对硝酸还原 酶（NR）活性的影响硝酸还原酶Ø植物从土壤中吸收的NO3－必须经代谢性还原才能被利用，因 为细胞组分中的N均呈高度还原态，而NO3－中的N为高度氧化 态Ø硝酸盐的还原由硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)催化 硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶 Ø诱导酶(induced enzyme):植物体本来不含有，但在特定外 来物质(如底物)的诱导下,可以产生的酶受光促进1. 实验目的意义 Ø 掌握硝酸还原酶活性的测定方法Ø 了解硝酸还原酶的特性硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写NR）是硝酸盐同化中第一 个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置它与植 物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响， 因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之 一，也可作为品种选育的指标之一硝酸还原酶可将NO3-还原成NO2- ，其反应为：NO3- + NADH + H+ NO2- + NAD+ + H2ONR在一定条件下，NO2-的生成量与硝酸还原酶的活性呈 正相关，因此，可以测定NO2-的生成量来代表硝酸还原酶 的NR活性。

2. 实验原理 NO2-含量测定（磺胺比色法）在酸性溶液中，NO2-与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与 α-萘胺偶联，形成紫红色的偶氮化合物该偶氮化合物 在540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）不稳定，见光容易分解，测定需迅速当磺胺与α-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成直线关系 NO2-含量标准曲线：[ NO2- ](µmol/ml) = 0.0026＋0.359OD540 NR活性(NO2- , µmol/h•gfw) = 鲜重(g)×时间(h)[NO2-] (µmol/ml)×稀释倍数离体法：将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液 为硝酸还原酶粗酶液进行测定 缺点：由于研磨中NADH受损失，必需外加NADH方可测定活体法：直接用鲜活组织进行测定环境中的NO3-进入细胞后 被NR还原成NO2-，并扩散到细胞外在溶液中积累，测 定溶液中NO2- 的含量即可得知NR的大小 优点：不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不 断生成，无需外加简便、快速，不需要贵重仪器设备 及低温条件 缺点: 重复性欠佳，应作一定量的重复硝酸还原酶活性测定3. 材料与试剂两种处理的小麦：水 (ck)， KNO3（N）A液：磷酸缓冲液: 水: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1 B液：磷酸缓冲液: KNO3: DNP溶液: 蔗糖溶液 ＝ 5: 5: 1: 1磷酸缓冲液(pH7.5): 0.2mol/L； KNO3溶液: 0.2mol/LDNP (2-4-二硝基苯酚)溶液: 1mmol/L； 蔗糖溶液: 2.5mmol/L 磺胺试剂 α-萘胺试剂v 取样前一天，用50mM KNO3加到培养小麦的水中，光照，以诱导硝 酸还原酶产生。

v 两种材料[水(ck)，KNO3 (N)]各取2份新鲜叶片中段，用蒸馏水洗净、 擦干，剪成1cm小段，称取0.3克；将4份（ck、N）叶段分别置于含 有10ml A、B溶液的两只试管中，即ckA、ckB、NA和NB四管；v 用纱布将材料压于试管底部，将试管放在真空干燥器中抽气30分钟 ，放气后摇晃直至叶段沉于溶液中； v 将试管置于25～30℃温箱中，黑暗保温30分钟；v 取A液和B液1ml代替反应液，加入2ml磺胺试剂和2mlα-萘胺试剂， 作为测定样品吸光值的对照管 v 立即吸取1ml反应液，加入2ml磺胺试剂，摇匀，再加入2mlα-萘胺试 剂（注意顺序），用漩涡仪混合摇匀，25 ℃水浴（水浴锅）反应5分 钟, 取出后桌面静置10分钟，随后5分钟内，在540nm测定样品的吸光 值 4. 实验步骤两种处理的小麦幼苗叶片 中段各取0.3g (各2份) 麦苗~水(ck) 麦苗KNO3 （N）10 mlA液 B液A液 B液抽气30分钟25～30℃温箱中黑暗保温30分钟取1ml反应液+2ml磺胺试剂+2ml α-萘胺试剂混匀注意加液顺序25 ℃水浴反应5分钟取出后桌面静置10分钟540 nm测定样品的吸光值取A液或B液1ml 代替反应液作为对 照管放气后摇晃直至叶 段沉于溶液中5. 结果与分析处处 理 A 液 B 液 吸光度 [ NO2- ] NR活性 吸光度 [ NO2- ] NR活性（uMol/ml）（uMol/h•gfw） （uMol/ml）（uMol/h•gfw）H2OKNO3对对照[ NO2- ] （uMol/ml）= 0.0026＋0.359OD540NR活性（ NO2- , uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜鲜重g×0.5h）分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。

6. 注意事项① 抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中；② 硝酸还原过程应在黑暗中进行；③ 磺胺试剂和α-萘胺试剂加入时，注意顺序；④ 正确使用分光光度计；⑤避免移液管使用交叉感染1） 为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进行？2） NR酶活性（ NO2- ，uMol/h•gfw）= [ NO2- ] ×10ml/1ml ÷（鲜重g×0.5h）公式中的0.5 h 指哪一个？7. 思考题酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生 亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时 可还原NO2- ，所以在暗条件下进行反应可阻止NO2- 的继续反应，以保证测定结果的准确。