病毒包装试验整体流程及原理慢病毒腺病毒全套资料.docx

病毒包装实验整体流程及原理 （慢病毒、腺病毒）全套资料 （全套资料，可以直接使用，可编辑 优秀版资料，欢迎下载）广州英思特生物科技为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务公司 wwwo insightbiotech病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞， 常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.11原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种构建的 siRNA / miRNA 慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面， Lentivirus —siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞 ，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达 ^12特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi研究和体内 实验中难于转染的细胞（比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞 ）。

2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株 ^3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究4）无需任何转染试剂，操作简便5）可以根据客户需要制备多种标记3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞 293T等3）培养48hrs — 72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液4）病毒的纯化和浓缩5）分装、-80 C保存6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告2、腺病毒11原理腺病毒（Adenovirus, Ad）是一种无包膜的线状双链 DNA病毒，其复制不依赖于宿主细 胞的分裂有近 50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型 2和5,通过转基因的方式取 代E1和E3基因，降低病毒的复制能力这些重组病毒仅在高水平表达 E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统2.2特点1）几乎可以感染所有类型的细胞2）可以获得复制缺陷型 （E1和E3缺失） 的腺病毒3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL ,能有效的进行增殖.4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广 ，制备容易，操作简单.5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性 高.1.2。

3腺病毒包装简要流程1） 构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体2）采用PacI消化纯化的质粒3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A细胞，收获细胞以制备病毒粗提液4）将病毒粗提液感染 293A细胞以扩增病毒5） 分装，一80 c保存3、慢病毒和腺病毒的比较慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较病是表达系统慢病毒表达系统（Lentivirus ）腺病毒表达系统（Adenovirus ）病是基因组RNA双链DNA病毒复制自主复制自主复制是否整合病毒基因组整合于宿主基因组，长时病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬间、稳定表达外源基因时表达外源基因感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞，适用于难转染的原代细胞（如神经细胞）及体内实验感染分裂和不分裂细胞表达风度中水平表达局水平表达表达时间慢（1 — 3天）快（1 — 2天）滴度滴度最高可达 10* 8pfU/ml滴度最高可达 10*11pfU/ml克隆容量可插入不超过8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、构建目的基因到载体21构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案 ，有以下两种手段。

1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点 ，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体,酶切，并测序鉴定2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行 PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切 ，并测序鉴定2.2质粒载体2.21概念能够进行自主复制的环状 DNA双链结构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿 体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸（ DNA）分子2.22特征质粒上常有抗生素的抗性基因， 例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等 有些质粒称为附加体（episome）,这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来 成为游离于染色体外的 DNA分子.质粒在宿主细胞体内外都可复制.通过个些特性，人们可以 把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而 不断的复制，来彳#到目的产物 .3、质粒DNAft大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增 ，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤1.1 大肠杆菌感受态细胞的制备1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于 3mlLB培养基的试管中，37 c振荡培养过夜.2）取0。

4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37c振荡培养2〜3h3）菌液转移到 50ml离心管中，冰上放置 10min4） 4 c 离心 10min （4000r/min）5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴 30min7）4 C离心 10min （ 4000r/min）8）倒出上清液，用冰浴的 01mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）9）分装细胞，200ul 一份,4 C保存32质粒DNA的转化1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒 DNA2ul混匀，冰浴30min2）离心管放到42 c保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液体培养基，37c培养1h （150r/min）5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置 30min6）倒置平皿37C,12〜16h,出现菌落3.3质粒提取步骤1）取1〜4ml在LB培养基中培养过夜的菌液， 12000转离心1min,弃上清2）加250ul溶液I /RNaseA（溶液I为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重 新悬浮，室温静置1-2min。

3）加入250ul溶液n （细胞裂解液），轻柔的反复颠倒混匀 5—6次室温放置1-2min,使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液4）加入350ul溶液出（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀 5 —6次，此时会出现白色絮状沉淀5） 12000室温离心10min,收集上清.6）将上清置于 DNA纯化柱中，静置1-2min7） 12000转离心1min,弃滤液8）加入500ul溶?夜PB （洗涤液）12000转离心1min,弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋 白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒 DNA.9）加入500ul溶液 W （去盐液），12000转离心1min,弃滤液，重复一次.10） 12000转离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体11）将DNA纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50-100ul溶液日uent （为无菌的双蒸水，PH 为8.0-8.5）,室温放置 2min12） 12000转离心1min,此时管底即为高纯度的质粒 DNA ,质粒于一20c保存质粒提取步骤：吸取液体培养基于15ml离心管中12000转离心1min,弃上清，吸取培养基重复离心弃上清离心，留取少量菌液作为菌种保存 ，可直接置于一20C—一加250ulBufferS1悬浮细菌，悬浮均匀一一加250ulBufferS2温和充分的上下翻转 4 6次混合均匀，使菌体裂解——加 350ulBufferS3温和上下翻转12000 离心10min——取上清液转移到专用的制备管（ 2ml） 12000转离心1min,弃滤液--加500ulBufferW112000 转离心1min,弃滤液一-加500ulBufferW212000转离心1min,弃滤液，重复一遍——将制备管置回 2ml离心 管12000转离心1min ——将制备管移入新的 1。

5ml离心管中，力口 60〜80ulEluent或离子水，室温1min12000转离心1min ——移去制备管，将有质粒的离心管于 4c或是一20c保存4、质粒DN用口其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（即病毒包装）41名词解释41.1293T细胞是由293细胞派生， 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系,被广泛应用 于瞬时转染以过表达各种目标蛋白， 或是用以包装病毒.脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜 ，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放4.2共转染的操作步骤第一天：用无抗生素 DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔确保第二天细胞密度达到80% —90%融合度第二天：1 500ul无血清培养基稀释 2ug表达质粒+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2 500ul无血清培养基稀释 15ul脂质体20003 5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止 20min4从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入 1ml质粒和脂质体混合物6 —10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液 DMED+10%FB（从 此刻开始算时间）。

第三天：1转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到 70%以上 第四天：1转染后48和72h分别收获含病毒的上清2.3000 rpm 离心20min , 0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀3.12000转离心浓缩细胞、分装一 80° C贮存滴度测定目的基因检定，并出具检测报告3病毒包装的原理质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（ RNA）,但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成 分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因， psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒， 其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜， pMD2G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转 录出的目的基因 RNA与psPAX2、pMD2G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒在上述程序中提及的 “第四天”收集病毒在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA ,该基因再整合到靶细胞的基因组中， 完成转染过程，因为质粒 DNA只能转录出病毒 RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖， 故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。

5、慢病毒感染细胞5.1流程图LengiB ExpnegrSKao System52感染步骤1）铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按 1 * 105/L密度接种于12孔板，生长过夜2）感染：将70-80%铺?。