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HBV耐药性及防治策略南昌市第九医院徐龙乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus , HBV)是目前世界上流行最广泛的病毒之一，HBV有较 高的变异性，其原因是由于HBV的复制是通过RNA中间体(前基因组RNA)利用病毒本 身的DNA多聚酶(polymerase)—DNA -P反转录成负链DNA，在反转录过程中，DNA-P 缺乏校对酶活性，不能修正核苷酸的错配，导致HBVDNA序列发生变异HBVDNA至少 含有4个开放读码框(open-reading frames，ORF)，即S区(包括S区、前S1区和前S2区)、 C区(包括C区和前C区)、P区和X区本文就HBV耐药及防治策略的最新研究进展作一 综述一、 HBV分子结构及复制周期HBV属于嗜肝DNA病毒，其基因全长仅3. 2 kb在HBV包膜内，HBV基因以不完全双链 环状DNA形式存在HBV感染人体肝细胞后，将包膜内HBV DNA释放入肝细胞核内并形成共价闭合环状DNA(cccDNA)宿主RNA聚合酶以cccDNA为模板，转录成mRNAmRNA亦为前基因组RNAHBV多聚酶以前基因组RNA为模板，逆转录合成负链 HBVDNA，然后再以负链DNA为模板合成正链HBV DNA。

最终形成子代HBV DNA由此 可见，HBV多聚酶在HBV复制过程中起着至关重要的作用二、 HBV耐药突变的定义及命名病毒对抗病毒药物的耐药分为表型耐药和基因型耐药表型耐药是指：在治疗期间病毒水平 上升，一般用抗病毒药物浓度(IC50)测定，IC50增加说明药物敏感性下降或耐药程度增 加，需要更大的药物剂量才能抑制变异的病毒基因型耐药是指病毒聚合酶基因突变，形成 新的病毒基因序列，一般采用DNA测序、基因芯片等方法测定发生变异的病毒常可改变 其生物学特性，给临床的防治带来一系列问题针对HBV耐药可分为表型耐药、基因型耐 药、临床耐药，临床耐药(cli ni cal resista nee)指临床出现病毒复制不能被抑制，或HBV复 制一度被抑制后又出现HBV DNA反跳，同时并伴有ALT升高已知核苷类药物耐药突变均发生在HBV多聚酶(DNA-P)上HBV分为8个基因型(A〜H) 各基因型HBV多聚酶长短不尽相同以A基因型HBV为参照,HBV多聚酶总长845个氨 基酸HBV多聚酶可分为4个功能区：终端蛋白(terminal protein)、间隔区(spacer)、 逆转录酶区(reverse tran scriptase)及RNA降解酶区(RNase H) 0 HBV耐药变异以国际 通行的氨基酸单字母加变异位点来标记。

例如,YMDD代表逆转录酶区的4个氨基酸(酪氨 酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸),其中的蛋氨酸(M)变为亮氨酸(V)或异亮氨酸(I)则会引起 拉米夫定耐药起初,HBV耐药突变的位置是从HBV多聚酶的第一个氨基酸数起由于HBV 8个基因型的HBV多聚酶长短不同,以不同HBV基因型为参照,YMDD所处的位点不同同样的YMDD变异被报道成M552V、M550V、M539V等不同命名为避免混乱,Stuyverg 等提议将HBV耐药突变统一从逆转录酶功能区(各基因型均为344个氨基酸)的第一个氨 基酸数起并加前缀rt (例如YMDD变异被命名为rtM204V) ° HBV多聚酶逆转录酶区包含 7个基因保留亚区(A〜G) °拉米夫定耐药突变主要发生在B和C亚区中HBV多聚酶 逆转录酶的三维结构犹如一只半张开的右手B和C亚区均位于手掌部位，紧靠拉米夫定结 合位点°rtM204V或rtM204I突变是引起拉米夫定耐药的一个直接因素从分子结构上讲,V 和I均比M多了一个0甲基而这个多出来的甲基造成拉米夫定结合位点的空间拥挤，从而 使拉米夫定不能有效地与HBV多聚酶结合三、 HBV耐药突变的机制由于HBV在体内复制的过程需要经过逆转录这一步骤，在反转录过程中，DNA-P缺乏校对 酶活性，不能修正核苷酸的错配，导致HBVDNA序列发生变异，HBV复制中的天然复制 错误率比其它DNA病毒要高10倍左右。

HBV基因在复制过程中不断产生天然变异，因而 在HBV感染者体内常形成一群由基因十分相似、但不完全等同的病毒株组成的准种 (quasispecies)在未接受过核苷类药物治疗的患者中,HBV野型株占HBV准种的绝大多 数耐药变异株在患者用药前就可能存在，也可在用药过程中产生患者用药后，对药物敏感 的野型病毒株受到抑制含有耐药突变的病毒株得以有更多空间进行复制当对某一药物有 耐药性的病毒株成为准种中的主要病毒株时，此药就失去疗效四、 主要HBV耐药突变治疗乙型肝炎的核苷类药物主要是通过与HBV多聚酶的天然底物(dNTP)竞争来达到抑制 HBV多聚酶的活性，从而达到抑制HBV复制的作用P基因区是HBV基因组中最大的ORF,全长2496bp，编码含832个氨基酸的多肽，称为 HBVDNA多聚酶(DNAP)，位于nt2357〜0〜1621之间HBV耐药株的变异发生在DNAP 基因的rt区临床研究已发现有各种不同药物的H B V耐药变异株，根据核苷(酸)类似 物耐药变异株的不同形式，可将现有的药物分为三组：(1 ) L-核苷(酸)类似物组包括拉 米夫定(Lamivudine，LMV)、依曲西他平(Emtricitabine, FTC)，替比夫定(Telbivudine,LdT)、克拉夫定(Clevudine,CLV)； ；2 )无环磷酸酯组，包括阿德福韦(adefovir dipivoxil,ADV)和替诺福韦(tenofovir, TFV)；(3)环戊烯组，包括恩替卡韦(entecavir, ETV)等。

1. L-核苷(酸)类似物组DNA聚合酶C区亚结构域(motif)是HBV进行逆转录的活性部位，由酪氨酸(Y)、蛋氨 酸(M)—天门冬氨酸(D)—天门冬氨酸(D)即YMDD组成，该部位正是LAM干扰HBV 复制的结合位点研究证明，YMDD中的rt204位蛋氨酸可被缬氨酸(V)或异亮氨酸(I) 取代，生成YVDD或YIDD,导致该亚结构域的空间构型改变，从而妨碍了与LAM的结合 YIDD变异可单独存在，而YVDD则常伴有多聚酶B区rt180位的亮氨酸(L)由蛋氨酸(M)取 代的变异变异后的HBV对LAM的敏感性显著下降与拉米夫定有关的主要耐药变异位 点为rtM204l/V,目前研究已发现与耐药有关的不同类型的突变形式包括：(1 ) r t M 2 0 4I / V +rtL180M； (2) rtM204I； (3) rtV173L +rtL180M + rtM204V； (4) r1L80I + rtM204I；(5) rtQ215S + rtM204I/V + rtL180M (6) rtll69T + rtV173L + rt 180M + rtM204V ； (7) rtA181T ； (8) rtT184S + rtM204I/V± rtL180M；(9) rtM204S + rtL180M，其中一部分 变异是作为补偿突变可增强病毒的复制活性或耐药性，一部分变异会影响到随后的治疗选择。

其他L-核苷(酸)类似物的耐药特点与拉米夫定相似，主要变异位点集中于rtM204I/V伴随 有一些其他位点的变异2. 无环磷酸酯组阿德福韦耐药变异位点集中于P基因D区rtN236T位点和(或)B区rtA181V/T，与拉米 夫定耐药主要集中于rtM204位点不同，阿德福韦耐药变异位点较为分散，除了上述两个位 点变异之外，还发现有 rtP237H、rtN238T/D、rtV84M、rtS85A、rtQ215S 及 rtV214A 等由于阿德福韦耐药突变形式与拉米夫定不同，因此阿德福韦耐药患者可应用拉米夫定或其他L-核苷（酸）类似物治疗，拉米夫定耐药也可采用阿德福韦治疗T F V对拉米夫定耐药毒株有效，但在同时感染HI V和HBV的患者中发现有对TFV及拉米夫定同时耐药的变 异株，该变异点位于B区和C区结合位点rtA194T，同时出现有rtL180M+rtM204V突变 这种联合突变株对TFV药物敏感性下降10倍以上3. 环戊烯组恩替卡韦耐药的突变形式主要有两种，均发生于拉米夫定耐药的患者：（1）rtM250V士rtl169T + rtM204V + rtL180M,（2） rtT184G+ rtS202G/l + rtM204V + rtL180M。

新近发 现rtV173L变异五、HBV耐药的防治1. 乙型肝炎病毒耐药变异的预测因素：多种因素可预测HBV对核苷（酸）类似物发生耐药几率如治疗开始时HBV DNA载量高、 有肝纤维化/肝硬化基础、曾接受过核苷（酸）类似物抗病毒治疗、耐药病毒株的适应能力强均 提示高耐药风险越来越多的研究提示早期病毒学应答情况也是预测耐药发生率的重要指标2. 乙型肝炎病毒耐药变异的预防策略：（1） 合理选择核苷（酸）类似物抗病毒治疗的适应证:对免疫耐受期或非活动期HBV感染者， 尤其是年龄较轻者,如不需要接受免疫抑制剂或化疗药物治疗，则不建议应用核苷（酸）类似物2） 合理选择抗病毒治疗方案:治疗方案参考中国“慢性乙型肝炎防治指南”应密切观察患者 治疗期间病毒学的应答情况此外，应尽量避免单药序贯治疗，以免多药物耐药的发生3）提高患者的依从性:在用核苷酸）类似物进行抗病毒治疗期间，要反复强调遵医嘱按时、足 量服药3. 定期监测应答情况,及时调整治疗方案：治疗期间每3个月检测一次HBVDNA 水平，如非依从性差所致，对原发性治疗失败或发生病 毒学突破者要及时进行基因型耐药检测，并鉴定变异模式,以指导换用其他治疗方案。

HBV DNA水平的动态变化是早期发现耐药变异的重要指标但分析结果时需注意不同实验室和 不同检测方法的敏感性有所差异4. 已发生耐药变异的临床处理建议：对少数治疗前ALT正常、肝组织学检查炎症或纤维化病变轻微（〈G1S1）者可停止抗病毒治 疗，但需密切监测,一旦有肝炎突发，及时再抗病毒治疗;对绝大多数核苷酸）类似物耐药者，尤 其是失代偿期肝硬化患者，需及早进行挽救治疗（rescue therapy）通常病毒学突破先于生 物化学突破，在生物化学突破前进行挽救治疗可使患者免于发生肝炎突发、肝病恶化挽救治 疗需根据病毒对不同核苷酸）类似物耐药特点加用或换用无交叉耐药的核苷酸）类似物；如 无禁忌证，亦可选用IFN2a或聚乙二醇化干扰素拉米夫定耐药加用阿德福韦或换用恩替卡 韦；阿德福韦耐药且拉米夫定初治患者应加用拉米夫定、或换用替比夫定或恩替卡韦；替 比夫定耐药处理与拉米夫定基本相同；恩替卡韦耐药加用阿德福韦或换用IFNa六、HBV变异的检测方法HBV变异主要的检测方法有1. PCR扩增法：PCR扩增-限制性酶切片断多态性分析(PCR-RFLP)是目前国内实验室常用 的YMDD变异、rtA181V阿德福韦酯耐药、BCP区变异位点的检测方法。

实时荧光PCR 扩增是近期国内应用较多的HBV耐药检测方法2. 基因芯片分析：包括流体芯片技术、探针杂交技术，主要通过逆向斑点杂交技术实现对 变异位点的检测3. 焦磷酸测序法：对血清标本的重复性及可靠性检测显示，质粒标准品的突变检出率及重 复率为100%，而血清标本为98.8%4. 基因克隆与测序：采用特异性引物对所在目的片断进行克隆后测序，通过与标准株的比 较识别变异位点这是所有检测方法中最为客观的检测方法，但操作复杂、成本高、耗时长 是该方法的主要缺陷七、结语自然界的任何物种都存在变异(mutati on),变异是生物适应环境和维持生存的一种重要方式, 是生物进化的规律,对遗传进化起到重要的作用HBV具有较高的复制率，据。