论弧菌科和气单胞菌科的常规检查(共67页).ppt

第十章 弧菌科和气单胞菌科的常规检查 石河子人民医院检验科 王乐n弧菌科包括弧菌属和发光杆菌属，是一大群菌体短小、弯曲成弧形、具有单端鞭毛、运动活泼、氧化酶试验阳性的革兰阴性菌n该类细菌广泛分布于自然界，以水中居多，人体肠道中偶有此类细菌存在n弧菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属鉴别要点 试验 弧菌属 气单胞菌属 邻单胞菌属 甘露醇 +/- + - 鸟氨酸 +/- - + 精氨酸 +/- +/- + O/129敏感 S R S TCBS生长 + - - 嗜盐性 +/- - -第一节 弧菌属n是一群氧化酶阳性，发酵葡萄糖，对弧菌抑制剂O/129敏感的细菌，钠离子能刺激其生长，其中有些菌株具有嗜盐特点（在无盐时不能生长）n目前发现本属细菌共有36个种，其中12种已被证明能引起人类感染或可从临床标本中分离得到最重要的是： 霍乱弧菌 副溶血弧菌一、霍乱弧菌（一）分类与特征 霍乱弧菌是引起烈性传染病霍乱的病原体该菌分为古典生物型和埃尔托（Eltor）生物型 霍乱发病急，传染性强，死亡率高 自1817年以来，已发生过7次世界性霍乱大流行，前6次均由霍乱弧菌古典生物型引起，1961年开始的第7次大流行由霍乱弧菌Eltor生物型引起。

1992年在印度、孟加拉等国发现一个新的流行株O139形态与染色 从患者体内新分离的霍乱弧菌形态典型，菌体弯曲呈弧形或逗点状，革兰染色阴性，菌体的一端有长为菌体3-5倍的单鞭毛，在米泔水样粪便标本中排列呈鱼群状该菌运动活泼，呈穿梭样或流星状 G- ，逗点状，1 根鞭毛，有菌毛 病人粪便作悬滴标本，可见“鱼群样穿梭” 无芽胞，无荚膜霍乱弧菌的革兰染色霍乱弧菌米泔样粪便直接涂片镜检培养和生化反应n兼性厌氧，最适生长温度35，耐碱不耐酸，在PH7.4-9.6范围内能生长，尤其在PH8.8-9.0碱性蛋白胨水或碱性琼脂平板上生长良好n营养要求不高，在普通营养琼脂上生长良好初次分离时常用碱性蛋白胨水增菌，由于其他杂菌受到抑制，而霍乱弧菌经6-9小时可在液体表面大量繁殖，形成菌膜n在碱性琼脂平板上，经18-24小时培养，形成较大、圆形、扁平、无色透明或半透明似水滴状的菌落n在选择性培养基硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板（TCBS）上，霍乱弧菌可形成较大的菌落，因发酵蔗糖产酸而使菌落黄色n在含亚碲酸钾的琼脂平板上，因还原亚碲酸钾成金属碲，形成中心呈灰褐色的菌落，较易辨认n在血琼脂平板上形成的菌落较大，Eltor生物型可产生溶血环。

n在SS琼脂平板上通常不长，麦康凯琼脂平板上多可生长霍乱弧菌在TCBS平板上菌落形态霍乱弧菌在亚碲酸钾平板上菌落形态抗原结构与分型n霍乱弧菌具有耐热的O抗原和不耐热的H抗原H抗原为弧菌属所共有，无特异性O抗原特异性高，根据O抗原的不同可把霍乱弧菌分成200多个血清群n其中O1群霍乱弧菌包括霍乱弧菌的古典生物型和Eltor生物型霍乱弧菌的两种生物型的鉴别 生物型 生物学特性 古典生物型 Eltor生物型 V-P试验 - + 溶血性（羊红细胞） - + 50U多粘菌素B纸片 S R 鸡红细胞凝集 - + 噬菌体组裂解 + - 噬菌体组裂解 - +霍乱弧菌古典生物型对多粘菌素B敏感霍乱弧菌Eltor生物型鸡红细胞凝集试验阳性n非O1血清群的霍乱弧菌广泛分布于地面水中，可引起人类胃肠炎，但从未引起过霍乱流行因这些血清群的细菌均不与O1群抗血清发生凝集，故称为非O1群霍乱弧菌，以往又称为不凝集弧菌nO139群既不被O1群抗血清所凝集，亦不被O2-O138群抗血清凝集，目前认为它可能是霍乱弧菌Eltor生物型菌株O抗原变异株抵抗力n对热、日光、干燥、酸、消毒剂敏感，但耐碱力较强100煮沸1-2分钟可杀灭细菌。

在正常胃酸中仅可存活4分钟，以1份含氯石灰加4份水处理患者的排泄物或呕吐物1小时可达消毒的目的nEltor生物型在自然界生存能力较古典生物型强，其在河水、井水及海水中科存活1-3周n对链霉素、氯霉素和四环素敏感，但Eltor生物型对一定浓度的多粘菌素B及庆大霉素有耐受性二、临床意义n霍乱弧菌引起烈性肠道传染病霍乱，霍乱为我国法定的甲类传染病n人类是唯一易感者n传染源是患者和带菌者致病机制n细菌通过污染的水或食物经口进入机体而感染，进入人体小肠内的霍乱弧菌，借助其鞭毛的运动及弧菌黏蛋白溶解酶和黏附素的作用穿过黏液层，并通过菌毛黏附于肠黏膜上皮细胞上，大量繁殖产生霍乱肠毒素，该毒素作用于肠黏膜表面受体，使肠黏膜细胞的分泌功能亢进，造成肠液的大量分泌，致使患者出现剧烈腹泻与呕吐，泻出物与呕吐物呈米泔水样，可致严重脱水，电解质紊乱和代谢性酸中毒n如治疗不及时，患者常因肾衰竭和休克而死亡，若及时补充液体和电解质，则大多数患者可在数日内恢复n霍乱弧菌古典生物型所致疾病较Eltor生物型严重近年来，由O139群霍乱弧菌所引起的霍乱暴发流行有上升的趋势，应给予高度重视n霍乱病后可获得牢固免疫力，主要是体液免疫。

n改善卫生条件，加强水源、食品、粪便的卫生管理，不生食贝壳类水产品等是预防霍乱弧菌感染和霍乱流行的重要措施加强国境检疫同时有计划得进行疫苗接种，提高人群免疫力n及时发现、隔离、治疗患者治疗的关键是补液，纠正水、电解质紊乱，预防大量失水导致的低血容量休克和酸中毒同时使用有效抗菌药物进行治疗三）微生物学常规检验n标本的采集与运送 发病早期及使用抗菌药物前采集标本 采集米泔水样粪便或呕吐物或肛拭等标本 标本及时接种，不能及时接种者，可将标本置于文-腊氏保存液内或卡-布保存液内运送带菌者可用无菌棉签挑取粪便标本或肛拭标本置于碱性蛋白胨水或卡-布运送培养基，35增菌6-8小时检验程序 标本 增菌培养 快速诊断 直接涂片 （碱性蛋白胨水） 动力、制动试验 6-8小时 分离培养（TCBS、碱性琼脂平板）18-24小时 血清学鉴定 初步报告 生化鉴定、分型 确诊报告检验方法（1）直接涂片：取标本直接涂片，干燥固定 后革兰染色，油镜下可见鱼群状排列的 革兰阴性弧菌2）动力及制动试验：取米泔水样粪便制备悬滴（或压滴）标本，观察细菌动力，可见穿梭及流星状运动的细菌同法另制备一标本片，加入1滴O1群霍乱弧菌多价诊断血清（效价64倍），可见运动活泼的细菌停止运动，并发生凝集，此为制动试验阳性。

免疫荧光菌球法、SPA协同凝集试验、溶原性噬菌体检查等 35增菌培养6-8小时 常用TCBS琼脂和碱性琼脂平板 三个步骤1）确定血清群：与O1群抗血清作凝集试验O1群、非O1群2）确定血清型：与分型血清A、B、C凝集3）生物分型:作生化试验古典生物型、Eltor生物型 O1血清分群 生物学分型 血清学分型 非O1群霍乱弧菌霍乱弧菌 小川型 古典生物型 稻叶型 彦岛型 O1群霍乱弧菌 小川型 Eltor生物型 稻叶型 彦岛型 霍乱弧菌的主要鉴定依据n（1）若细菌的菌落及形态典型，涂片为革兰阴性弧菌或杆菌，运动活泼，氧化酶试验、靛基质试验和黏丝试验阳性，与O1群霍乱弧菌的多价诊断血清发生明显的凝集可诊断为霍乱弧菌n（2）若细菌的菌落、形态及生化反应与霍乱弧菌相似，但与O1群霍乱弧菌多价诊断血清不凝集，应作进一步鉴定，以确定是否为非O1群霍乱弧菌或其他类似弧菌n（3）根据流行病学调查的需要，可进一步用霍乱弧菌的单价诊断血清作血清学分型必要时还可作噬菌体分型和生物分型二、副溶血性弧菌n一种嗜盐性弧菌n广泛分布于近海的海水、海底的沉积物和鱼类、贝类海产品中n主要引起食物中毒（一）主要特征n形态与染色 革兰阴性杆菌，随培养基不同菌体形态差异较大，有卵圆形、棒状、球杆状、梨状、弧形等多种形态。

该菌两极浓染，有周鞭毛或极端鞭毛，运动活泼 无芽胞，无荚膜培养特性与生化反应n需氧或兼性厌氧n营养要求不高，在3.5%氯化钠的培养基中生长良好，无盐或氯化钠的浓度高于8%不生长n最适生长温度为35n在碱性蛋白胨水中经35、6-9小时培养后呈均匀浑浊生长，并形成菌膜n在TCBS平板上形成0.5-2.0mm大小、不发酵蔗糖的绿色或蓝绿色菌落n在3.5%食盐琼脂平板上菌落圆形、隆起、边缘不整齐、光滑湿润不透明，并呈蔓延生长n在血液琼脂平板上形成较大（直径2-3mm）圆形隆起、湿润并略带灰色或黄色的菌落某些菌株可呈溶血n在SS琼脂上，部分菌株不生长，能生长的菌落较小（1-2mm）、扁平、无色半透明、蜡滴状，有辛辣味，不易挑起n初次分离时，该菌不能在伊红美蓝琼脂或中国蓝琼脂上生长，部分菌株可在麦康凯平板上生长，菌落呈圆形、边缘整齐、半透明或混浊状n副溶血性弧菌的生化反应培养基中需加入3.5%NaCln几乎所有自患者粪便中分离的致病性菌株都能溶解人和兔红细胞，不溶解马红细胞，称神奈川现象而从海水及海产品中分离的非致病菌株多不能溶解人和兔红细胞抗原构造n副溶血性弧菌有菌体(O)抗原、荚膜(K)抗原及鞭毛(H)抗原。

nO抗原共有13种，是副溶血性弧菌分群的依据K抗原有68种，可根据K抗原和O抗原的组合进行定型抵抗力n对氯、苯酚（石炭酸）、甲酚皂（来苏尔）等消毒剂敏感，不耐热，65 30分钟即被杀死n在淡水中生存不超过2日，但在海水中能生存47天以上，盐渍酱菜中存活30天以上n耐碱不耐酸，在2%冰醋酸或食醋中5分钟死亡n对氯霉素敏感，对新霉素、链霉素、多粘菌素、呋喃西林、吡哌酸中度敏感，对青霉素、磺胺嘧啶耐药 二、临床意义n从致病性副溶血弧菌中分离出两种致病因子： 1、耐热直接溶血素，其作用是通过增加上皮细胞内的Ca2+而引起Cl-的分泌，实验表明，该溶血素还具有细胞毒和心脏毒作用 2、耐热相关溶血素，其作用与耐热直接溶血素相似 此外，黏附素与黏附素酶也与致病性有关n人因食入被副溶血性弧菌污染而烹饪不当的海产品，如海蜇、海鱼、海虾、海贝等，或盐渍食物，如咸菜、咸肉、咸鱼等而引起食物中毒潜伏期平均24小时，患者可出现腹痛、腹泻、呕吐、发热等症状，粪便多为水样或糊状，少数为血水样多发于夏秋季节，一般恢复较快病后免疫力不强n该菌偶尔引起肠道外感染，如中耳炎、伤口感染等三）微生物学常规检验n标本采集 常规标本为患者粪便、肛拭子、可疑食物。

该菌对干燥敏感，标本采集后立即送检，如不能及时送检，应将标本置于1%NaCl的碱性蛋白胨水或含3.5%NaCl蛋白胨水中，35增菌培养6-8小时挑取菌膜或表面生长物进一步分离培养检验程序 标本 增菌培养（3.5%NaCl蛋白胨水） 分离培养（TCBS或3.5%NaCl琼脂） 可疑菌落（蔗糖阴性的绿色菌落） 纯培养（营养琼脂或KIA） 毒素鉴定 鉴定（生化、血清学试验）检验方法n1.增菌培养 将标本接种到含1%NaCl的碱性蛋白胨水或含3.5%NaCl蛋白胨水中，35增菌培养6-8小时挑取菌膜或表面生长物进一步分离培养n2.分离培养 将标本或上述增菌液接种于TCBS平板、3.5%NaCl琼脂平板或SS琼脂平板上，35培养18-24小时后，观察菌落特征n3.鉴定 副溶血性弧菌在不含NaCl和含10%NaCl的蛋白胨水中不生长，在含3%NaCl和含7%NaCl的蛋白胨水中生长；赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶试验阳性，精氨酸双水解酶试验阴性，脲酶多为阴性，少数为阳性从腹泻患者中分到的多数菌株神奈川现象阳性n4.与溶藻弧菌鉴别 由于从食物和粪便中经常能分离到溶藻弧菌，该菌在海水和海产品中分布也较多溶藻弧菌主要引起伤口感染和中耳炎，也可引起食物中毒和败血症。

溶藻弧菌和副溶血性弧菌同属弧菌属6群，其生化反应非常相似，应注意两者之间的鉴别 溶藻弧菌 副溶血性弧菌 蔗糖发酵试验 + - VP试验 + - 7%NaCl中生长 + + 10%NaCl中生长 + -溶藻弧菌在TCBS平板上的菌落特征溶藻弧菌在麦康凯平板上的菌落特征第二节 气单胞菌属和邻单胞菌属一、气单胞菌属（一）分类与特征n气单胞菌属隶属气单胞菌科，广泛存在于自然界，可从土壤、水源及人的粪便中分离出来，与人类疾病相关的主要有豚鼠气单胞菌。