医学生化与分子生物学实用技术课幻灯.ppt

分子生物学实验技术总体设计•时间：周二 8：30~10:00•地点：309室•内容：讲授： 1.重组DNA的实验方案 2.相关概念 3.目的基因的获得——cDNA mRNA 提取、PCR(酶切位点） 实验：上午 1.mRNA 提取 2. PCR 下午 3. 电泳(分组操作） •时间：周三 •地点：309室•实验：上午 1.PCR产物纯化回收（分组操作） 2.酶切（分组操作） 3.电泳 4.切胶回收 下午 1.连接 2.转化（分组操作）•时间：周四 •地点：309室•实验：下午：质粒提取（分组操作） 酶切电泳（略） •主要知识点：基因重组的概念及过程；用于重组DNA技术的理想载体应该具备的特点；获得目的基因的途径；真核表达体系的优点；常用真核细胞转染方法的种类；RT-PCR的基本实验步骤（包括PCR）；限制性内切酶的特点重组重组DNA技术技术 Recombinant DNA Technology• 重组重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或来自同一始祖的相同副本或 拷贝的集合。

拷贝的集合获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，， 即即无性繁殖无性繁殖• DNA克隆克隆 技术水平：技术水平： 分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　个体克隆（动物或植物）　DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（（同同源源的的或或异异源源的的、、原原核核的的或或真真核核的的、、天天然然的的或或人人工工的的DNA））与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子——复复制制子子(replicon)，，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分 子子 ，， 也也 称称 基基 因因 克克 隆隆 或或 重重 组组 DNA (recombinant DNA) 目的目的①① 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA ②② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) —— 实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程基因工程，，又称重组又称重组DNA工艺学。

工艺学重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNAcDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录鉴定（测序）鉴定（测序） 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录•载载 体体•定义：定义： 能够携带外源基因并且具有自主复制能力的能够携带外源基因并且具有自主复制能力的DNA,是将目的是将目的DNA导入受体细胞的工具导入受体细胞的工具在重组在重组DNA技术中，常用基因载体有两种类型：技术中，常用基因载体有两种类型：克隆载体克隆载体表达载体表达载体•载体的特点载体的特点•具有自主复制能力，保证重组具有自主复制能力，保证重组DNA分子可以在宿主细胞分子可以在宿主细胞内得到扩增；内得到扩增；•具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开，分开，便于分离提纯；便于分离提纯；•具有一个或多个筛选标记（如对抗生素的抗性、营养缺具有一个或多个筛选标记（如对抗生素的抗性、营养缺陷型或显色表型反应等），便于重组体的筛选和鉴定；陷型或显色表型反应等），便于重组体的筛选和鉴定；•有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点，便于目的基因的克隆；位点，称为多克隆位点，便于目的基因的克隆；•分子量相对较小，易于操作，以容纳较大的外源分子量相对较小，易于操作，以容纳较大的外源DNA；；•具有较高的遗传稳定性；具有较高的遗传稳定性；•使用安全。

使用安全•载体种类载体种类 1. 质粒质粒(plasmid) 2. 噬菌体噬菌体(phage) 3. 柯斯质粒柯斯质粒/粘粒粘粒 （（cosmid）） 4. 人工染色体：人工染色体： 细菌人工染色体细菌人工染色体 （（bacterial artificial chromosome,BAC）） 酵母人工染色体酵母人工染色体 （（yeast artificial chromosome,YAC）） 哺乳动物人工染色体（哺乳动物人工染色体（mammalian artificial chromosome,MAC）） 5. 动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）•质粒质粒 (plasmid)特点特点 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；；带带有有某某些些遗遗传信息传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。

会赋予宿主细胞一些遗传性状 细细菌菌中中独独立立于于染染色色体体外外的的双双链链闭环闭环DNA分子目的基因的获取1. 化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其 产物的氨基酸序列产物的氨基酸序列 2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)5.从已有重组载体中获得从已有重组载体中获得mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制* 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶ⅠⅠ碱水解碱水解 T T T T目目 录录 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应 Polymerase Chain Reaction 以拟扩增的以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与分子为模板，以一对分别与模板模板5′末端和末端和3 ′末端相互补的寡核苷酸片段为引末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这合成，重复这一过程，即可使目的一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。

这一过程片段得到扩增这一过程成为成为PCRn 模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n 耐热耐热DNA聚合酶（聚合酶（Taq 酶）酶）n dNTPsn Mg2+ PCR体系基本组成成分体系基本组成成分PCR的基本反应步骤的基本反应步骤1.变性：将反应系统加热至变性：将反应系统加热至95℃ ，使模板，使模板DNA 完全变性成为单链；完全变性成为单链；2.退火：将温度下降至退火：将温度下降至50℃左右，使引物与模板左右，使引物与模板 DNA退火结合；退火结合；3. 延伸：将温度升至延伸：将温度升至72℃ ，，DNA聚合酶以聚合酶以dNTPs 为底物催化为底物催化DNA的合成反应的合成反应 上述三个步骤为一个循环，经上述三个步骤为一个循环，经25～～30次循环后，次循环后，可将模板可将模板DNA扩增达百万倍扩增达百万倍 PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95˚C延伸延伸72˚C退火退火50˚C5 Primer 15  Primer 2Cycle 2Cycle 15 5  5 5  5  5 Template DNA5 5  5 5 5  5  5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目 录录Cycle 35 5  5 5 5  5  5 5 5  5  5 5  5 5 5  5 25～～30 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。

万倍以上目目 录录Cycle 3重组DNA技术的基本过程及技术路线•分-获取目的基因•切-限制性内切酶•接-连接目的基因及载体•转-重组子转入宿主细胞•筛-筛选出含有重组子的宿主细胞 mRNA 提取提取cDNAPCR琼脂糖电泳琼脂糖电泳RT-PCR 凝胶中回收凝胶中回收PCR产物产物目的目的DNA与与载体双酶切载体双酶切DNA与载体的连接与载体的连接转化转化 质粒的提取质粒的提取酶切酶切鉴定鉴定测测 序序表表 达达以构建以构建pBSK-Akt1-WT重组体为例重组体为例 一、PCR扩增得到Akt1/PKB的cDNA 设计基因特异性引物设计基因特异性引物a、、b，，以克隆在质粒以克隆在质粒pCIS2-Akt1上的上的Akt/PKB cDNA为模板为模板5 5 ́端引入端引入HindⅢ酶切位点，酶切位点，3 3’引入引入BamHI酶切位点，以酶切位点，以a、、b为引物，扩增野生型为引物，扩增野生型Akt1/ PKB •引物a(划线部分为HindⅢ酶切位点)：•5′-GCGAAGCTTCCATGAACGACGTAGCCATTGT-3′•引物b(划线部分为BamHI 酶切位点)： •5′-ATTGGATCCTCAGGCTGTGCCACTGGCTGAG-3′PCR产物末端限制酶切位点的切断情况产物末端限制酶切位点的切断情况10×PCR反应缓冲液 5.0 l dNTP mix(2mmol/L) 4.0 l Ex Taq DNA聚合酶(5U/l ) 0.25 l 引物 a (10pmol/l ) 2.0 l 引物 b (10pmol/l ) 2.0 l pCIS2-Akt1 5ng加水至 50 l 应用应用TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶，聚合酶，反应体系为反应体系为50 l 94℃预变性1min，然后按照94℃ 30sec，63℃ 45sec，72℃ 1min，进行29个循环，最后72℃延伸10min 。

 电泳检测 PCR结果 PCR产物的回收和鉴定产物的回收和鉴定 将上述PCR产物全部电泳，然后按照TaKaRa DNA凝胶回收试剂盒的说明书回收PCR产物  电泳检测回收的电泳检测回收的PCR产物产物二、二、PCR产物和表达载体的限制性内切酶酶切产物和表达载体的限制性内切酶酶切1、、酶切体系的组成及注意事项酶切体系的组成及注意事项 内切酶内切酶：根据实验的目的选择限制性内切酶对于基因克隆，选择粘性末端可提高连接效率DNA：DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含有过量的酚、氯仿、乙醚、大于10mmol/L的EDTA、SDS以及过量的盐离子浓度，以免影响限制性内切酶的活性 反应缓冲液反应缓冲液：每一种限制酶都有其一系列最佳反应条件，甚至来源于不同厂家的同一种限制酶的反应缓冲液也不尽相同，应该严格遵照产品说明书进行操作 2 2、、限制酶操作时应注意的原则：限制酶操作时应注意的原则：•限制性内切酶从冰箱中取出后，应置于冰中一般总是在其它试剂加完后，再加入内切酶•必须使用新的灭菌吸管，1个吸管不能反复使用，更不可交叉使用•内切酶的容积不能超过反应总容积的10％，否则使甘油终浓度达到5％将会抑制酶在该体系中的活性。

•酶应分装成小份当切割大量DNA时，通常用延长反应时间来减少酶的用量•同一种内切酶消化多个DNA样品时，应计算所需酶的总量，再将酶稀释液分配到各个反应管中，以减少酶液储存管的污染机会 PCR产物(或pBluescript II/SK) 12μl10×Y+/Tanqo（with BSA） 2μlHindⅢ(10U/ l ) 1.5μlBamHI (10U/l ) 1.5μl补水至 20μl三、三、PCR产物与载体的连接产物与载体的连接 建立连接反应时注意建立连接反应时注意：1 1、温度粘性末端的连接一般在16℃进行，以保证粘性末端退火及酶活性、反应速率之间的平衡2 2、酶量 3 3、、DNA量量载体与目的DNA的分子数比例一般为1:3四、重组体导入受体细胞四、重组体导入受体细胞 受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式导入方式转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)在重组在重组DNA技术中技术中转化：将质粒转化：将质粒DNA或以它为载体构建的重或以它为载体构建的重 组子导入细菌的过程。

组子导入细菌的过程转染：病毒及其重组子导入真核受体细胞转染：病毒及其重组子导入真核受体细胞转导：噬菌体及其重组子导入受体细胞转导：噬菌体及其重组子导入受体细胞真核细胞转染的方法•脂质体法•磷酸钙法•电穿孔法•DEAE葡聚糖法•显微注射法转化步骤转化步骤：•将60l E. coli JM109感受态细菌 置于冰上溶化；•加入2 l重组体；•冰上放置30分钟， 42℃水浴90 秒，迅速放入冰中骤冷3分钟；•加LB培养基至1ml ，轻轻摇荡，37℃振荡培养1.5h，使得细菌恢复正常并让氨苄青霉素抗性基因表达 五、重组体的筛选与鉴定五、重组体的筛选与鉴定 直接选择法直接选择法: (1) 抗药性标记选择：抗药性标记选择： (2) 标志补救：如蓝白筛选标志补救：如蓝白筛选 (3) 分子杂交法：分子杂交法： 原位杂交原位杂交 Southern印迹印迹 免疫学方法免疫学方法：利用特异抗体与目的基因表达产物相互：利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选。

作用进行筛选 如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等1、筛选阳性菌落并扩大培养：、筛选阳性菌落并扩大培养： 取150 l转化后的液体涂布于Amp + 的琼脂平板培养基中，37 ℃培养过夜挑取单菌落于Amp + LB 培养基中，37℃振荡培养过夜 试剂：试剂：•溶液I : 50mmol/L葡萄糖;25mmol/L Tris-HCl(pH8.0); 10mmol/L EDTA•溶液II: 0.2mmol/L NaOH;1% SDS(此溶液必须新鲜配制)•溶液III: 5mol/L KAc 60ml;冰醋酸 11.5ml;水 28.5ml配制 好的溶液III含3mmol/L钾盐、5mol/L 醋酸(pH4.8)•酚•氯仿•乙醇•TE•RNase步骤：步骤：•取1～1.5ml细菌培养液移至Ep管中， 12000g ，4℃离心 1分钟，弃上清；•将细菌沉淀悬浮于100 l冰预冷的溶液I 中，强烈振荡沉淀；•加入200 l溶液II，盖严管盖颠倒微型离心管5次以混合内容物，不要强烈振荡，放置冰上5～10分钟左右；•加入150l溶液III，可以将管盖朝下温和振荡10秒钟，冰上放置3～5分钟；•4℃，12000g离心，5-10min，取上清移至另一Ep管中；•加入等体积的酚/氯仿抽提，振荡混匀，4℃，12000g离心2min，取上清移至另一Ep管中；•用2倍体积的乙醇，振荡混匀，室温放置2分钟；•12000g ，4℃离心5分钟；•弃上清，加入1ml 70％(4℃)乙醇振荡漂洗沉淀， 12000g ，4℃离心2分钟；•弃上清，将Ep管倒置放在滤纸上，室温干燥沉淀；•用50 l含有无DNA酶的RNA酶(20g/ml)的TE重新溶解核酸，温和振荡几秒钟后可进行内切酶酶切实验或贮存于－20℃3、重组质粒酶切鉴定、重组质粒酶切鉴定 重组质粒用HindⅢⅢ 和BamHI 双酶切，反应体系如下： 质粒DNA 5 l 10×Y+/Tanqo（with BSA） 1 l BamHI (10U/ l) 0.5 l HindⅢ(10U/ l) 0.5 l 加水至 10 l酶切反应结束后，电泳检测酶切结果。

DNA重组技术重组技术构建重组体构建重组体转化转化筛选筛选重组体的检测重组体的检测表达体系的选择表达体系的选择重组体的表达重组体的表达选择载体选择载体获得目的基因获得目的基因原核表达与真核表达体系 大肠杆菌是常用的原核表达体系，具有遗传背景清晰、成本低廉、表达水平高的优点真核蛋白常具有翻译后修饰加工，比如糖基化、磷酸化、乙酰化、多聚化、二硫键形成等等在原核表达体系中，不能完成这些翻译后修饰加工，常常使一些表达的真核蛋白没有活性，而真核表达系统具有翻译后修饰加工的能力，常可获得有活性的表达蛋白实验一、组织总RNA的提取•试剂：RNAout、氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNAse free水•步骤： 1.将组织样品剪碎； 2.按50~100mg组织加1ml的RNAout，匀浆30秒； 3.按每1ml的RNAout加入0.2ml氯仿，涡旋震荡30秒； 4.离心13000转/分，3分钟； 5.取上清液（约0.6ml）转移入新的EP管；注意：取上清要避免吸入中间层，防止DNA或蛋白质污染 6.上清液中加入等体积异丙醇，涡旋震荡30秒； 7.离心13000转/分，5分钟； 8.小心弃上清； 9.EP管中加入1ml的75%乙醇，震荡30秒； 10.13000转/分，离心1分钟； 11.小心弃上清； 12.重复9~11步一次； 13.短暂快速离心，吸弃残留乙醇；注意：尽量不要残留乙醇，会影响到RNA的使用。

14.室温放置1~2分钟，加入RNAse free水50ul溶解注意：应使用无RNAse的水溶解RNA 15.RNA的浓度与纯度测定 OD260=1(40ug/ml) OD260/OD280=1.8~2.1实验二、RT-PCR1.试剂：通用型RT-PCR试剂盒2.RT的反应体系（20ul）：溶液A（随机引物RP）1ul溶液B（dNTP）1ul溶液D（5*RT buffer）4ul溶液E（酶混合液）1ul提取的总RNA 1ul溶液G（DEPC水）12ul3.RT步骤： 混匀上述反应体系，42度60分95度5分钟，4度1~5分钟4.PCR反应体系（50ul）： RT反应产物 4ul 溶液F（10*PCR buffer）5ul 溶液B（dNTP）1ul 上游引物（10uM） 2ul 下游引物（10uM）2ul 【溶液H（阳性对照引物beta-actin）1ul】 溶液C（taq酶）1ul 溶液G（DEPC水）35ul5.PCR的步骤： 94度预变性1分钟 94度30秒 55度30秒 72度30秒 30个循环 72度5分钟。