hSDF 1α-CXCR4介导骨髓源间充质干细胞迁移的信号转导.doc

1hSDF 1α/CXCR4 介导骨髓源间充质干细胞迁移的信号转导作者：王新均，唐俊明，孔霞，郭凌郧，杨建业，郑飞，陈龙，黄永章，王家宁 【摘要 】 　　目的：利用 Boyden chamber 体外迁移体系初步探索基质细胞衍生因子 1(SDF 1) 在骨髓源间充质干细胞（MSC ）迁移中的作用及其信号转导机制. 方法：采用经典的全骨髓贴壁法培养 MSC, 通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD133，CD34，CD90，CD105）等鉴定 MSC 特征；以 P3 MSC 为实验材料，利用 Boyden chamber 体外迁移体系，观察不同浓度的 hSDF 1 对 MSC 迁移的影响，以 50 nmol 渥曼青霉素，10 mmol LY294002，50 mmol PD98059，10 mmol U73122，0.1 g/L AMD3100 等不同处理 P3 MSC，观察最适宜浓度的 hSDF 1 对 MSC 迁移影响的信号转导机制. 结果：培养的MSC 呈现出 CD90，CD105 强阳性，具有成骨、成脂肪等多向分化能力； MSC 体外迁移能力随着 hSDF 1α 浓度（1，10 ， 100，500 μg/L）的递增而逐渐增强，并且 hSDF 1α浓度在 100 μg/L 时，MSC 迁移到滤膜上的细胞数接近于峰值；渥曼青霉素，LY294002，PD98059，U70312，AMD3100 ，维拉帕米对 MSC 迁移均有影响，其中 U73122，AMD3100 对 MSC 迁移2阻断的效应最显著. 结论：SDF 1/CXCR4 所介导的 MSC 迁移与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK） ，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶 C 和蛋白激酶 C(PKC)等信号途径有关, 且 PKC 途径可能处于中心环节. 【关键词】 间充质干细胞；迁移;蛋白激酶 C；信号转导 【Abstract】 AIM: To explore the role of stromal cell derived factor 1 (SDF 1) in the migration of mesenchymal stem cell (MSC) and its signal transduction mechanism. METHODS: MSC culture was performed with the classical whole bone marrow adhering method; characteristics of MSC were identified through the induction of multiple differentiation into osteoblasts or lipoblasts, and surface marker assay (CD133, CD34, CD105); by using Boyden chamber in vitro migration assay system, the effects of SDF 1 concentrations on P3 MSC migration were observed and the signal transduction pathways related to P3 MSC migration were analyzed. RESULTS: Cultured MSC had the potential of menbrane differentiation and highly expressed CD105 and CD90; the efficiency of MSC migration into the filter membrane increased gra dually with the increase of hSDF 1concentration （1, 10, 100, 500 μg/L）, and MSC number in the filter membrane was appro ximately maximum when hSDF 1 was 100 μg/L. 50 nmol wortmannin, 310 mmol LY294002, 50 mmol PD98059, 10 mmol U73122 and 0.1 g/L AMD3100 were all able to decrease the number of MSC in the filter membrane, and what s more, U73122 and AMD3100 treatments were most effective in blocking the MSC migration. CONCLUSION: SDF 1/CXCR4 mediated MSC migration is related to mitogen activated protein kinase ( MAPK), phosphatidylinositol phospholipase C (PI PLC) and protein kinase (PKC) signal pathways, but PKC signal pathway may be the central role in MSC migration. 【Keywords】 mesenchymal stem cell; migration; PKC; signal transduction 0 引言 研究已发现，骨髓来源的间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell, MSC）在一定条件下可以分化为心肌、成骨、软骨、脂肪、胰岛、肌腱等多种类型的细胞. 在心肌内、静脉内、冠脉内等不同途径移植 MSC 或粒系集落刺激因子动员骨髓，发现其可以迁移到心肌梗死部位，通过参与血管新生、心肌再生等改善修复受损的心脏［1］. 目前有关 MSC 迁移至心肌部位的机制仍不清楚. 有研究发现，表达 CXCRA 的造血干细胞（hemotopoietic stem cell，HSC）能够沿着基质细胞衍生因子1（stromal cell derived factor 1, SDF 1）的浓度梯度迁移实现迁移归巢过程［2］ . 新近的研究发现 MSC 也表达 CXCR4［3］. 4我们研究体外迁移体系 SDF 1 对 MSC 迁移的影响，初步探索MSC 的迁移机制是否与 HSC 具有类似的特征. 1 材料和方法 1.1　 材料 SPF 级 Wistar 大鼠 3 只,体质量（230±20）g，动物合格证号为 SCXK(鄂) 2003 005 ，实验动物使用许可证号为 SYXK(鄂)2004 021. 动物在屏障系统环境下，用专用饲料和灭菌水分笼饲养（湖北省实验动物中心提供）. DMEM 培养基（美国 Gibcol/BRL公司） ； 胎牛血清（杭州四季青工程材料研究所） ；胰酶（美国Sangon 公司） ；CO2 细胞培养箱（美国 Scientific 公司） ；倒置荧光显微镜(日本 Nikon 公司)；恒低温切片机(德国 Leica 公司)； 图像分析系统 5.02(美国 Media Cybernetics 公司） ；hSDF 1α（upstate ） ；地塞米松，β  磷酸甘油，维生素 C，胰岛素，4，6  联脒 2  苯基吲哚（4,6 diamidino 2 phenyl indoledi  acetate,DAPI)，SDF 1特异性受体 CXCR4 阻断剂 AMD3100，维拉帕米(verapamil)（美国 Sigma 公司） ；CD105，CD90，CD133 和 CD34，磷酰肌醇 3激酶阻断剂渥曼青霉素（Alexis biochemicals） ，LY294002，丝裂原活化蛋白激酶阻断剂 PD98059（Bioscience） ，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶 C 特异性阻断剂 U73122（Bioscience）,微孔聚碳酸酯膜（美国 Millipore 公司）. 1.2　 方法 51.2.1　MSC 的培养［ 1］ 采用全骨髓法. 给予大鼠腹腔注射肝素 5000 U, 15 min 后断颈处死, 收集双侧胫股骨中全骨髓. 按 1×109 细胞/L 接种于 75 cm2 培养瓶，24 h 后换液, 去除未贴壁的细胞 . 以后 3～4 d 完全换液 1 次， 12～14 d 后细胞密度达 80%～90%, 用 2.5 g/L 的Trypsin 消化后 1∶3 传代, 记为 P1 代 MSC(P1 MSC). 随后按上述方法传代培养. 培养的 P3 代 MSC(P3 MSC)中加入终浓度为 50 mg/L 的 DAPI 温育 1 h，荧光显微镜下观察其 DAPI 标记的效率为100%［1］. 消化收集 P3 代的 MSC(P3 MSC)，制成 1×109/L 细胞悬液，以备迁移实验. 细胞培养条件：含 150 mL/L 的胎牛血清,1×105/L 青霉素,100 mg/L 链霉素和 0.25 mg/L 两性霉素 B 的DMEM 培养基，37℃, 50 mL/L 的 CO2 饱和湿度. 1.2.2　MSC 的鉴定 1.2.2.1　成骨诱导 P3 MSC 培养至 90％融合后 6 孔板加入成骨诱导液(150 mL/L FBS DMEM,含地塞米松 4×10-6 g/L，β  磷酸甘油 1 g/L，维生素 C 0.5 g/L)，每 72 h 换液，诱导 2 wk. Von Kossa s 染色鉴定矿化结节. 1.2.2.2　成脂肪诱导 P3 MSC 培养 至 90％融合后 6 孔加入成脂肪诱导液(10 mg/L 胰岛素), 每72 h 换液. 苏丹Ⅲ染色鉴定脂肪细胞 . 1.2.2.3　流式细胞术鉴定 6MSC 表面标记特征用 1 mL 注射器将 MSC（密度为1010/L）吹打混匀后，取 600 μL（至少含有 2×106 个细胞） ，等分为 4 份，分别加入 4 个 Eppendorf 管中. a 管为标准对照，加入4 μL 大鼠 IgG1 FITC 及 4 μL 大鼠 IgG1 PE mAb（荧光二抗） ；b管加入 4 μL CD34 FITC 和 4 μL CD133 PE mAb（一抗） ；c 管加入 4 μL CD90 mAb（一抗） ；d 管加入 4 μL CD105 mAb（一抗） ，4℃下避光孵育 40 min，洗涤液 1000 r/ min，离心 5 min，用PBS 洗 1～2 次. 在 c，d 管中加入 8 μL 大鼠 IgG1 FITC（荧光二抗） ，4℃下避光孵育 20 min. 洗涤液洗 2 次. 加入固定液 1 mL，上流式细胞仪检测表面标志，应用 Cotfit 软件分析结果. 1.2.3　体外迁移实验 利用 Boyden chamber 体外迁移体系［4］ ，滤膜为微孔聚碳酸酯膜（直径为 13 mm,孔径为 8 μm） , 上层体系为 250 μL 20 mL/L FBS 的 DMEM 培养基,其中含 1×108 P3 MSC/L. 下层体系为 250 μL 20 mL/L FBS 的 DMEM 培养基，其中分别含有1，10 ，100，500 μg/L 等不同浓度的 hSDF 1α. 置于培养箱中60 min. 取滤膜, PBS 洗 3 次，40 g/L 多聚甲醛固定 15 min,PBS洗 3 次，荧光显微镜下观察膜上细胞数 . 随后分别用渥曼青霉素 (50 nmol)，LY294002(10 mmol/L)，PD98059(50 mmol/L)，U73122(10 mmol/L)，AMD3100(0.1 g/L)，钙通道阻断剂维拉帕米(50 nmol/L)处理 P3 M。