长春新碱对可移植性小鼠淋巴细胞白血病的疗效及其机制研究.doc

1长春新碱对可移植性小鼠淋巴细胞白血病的疗效及其机制研究作者：朱大诚，尹小明，陈秀珍，罗小泉，闵建新【摘要 】 　　目的探讨长春新碱（ Vincristine，VCR）对 L615白血病的疗效及其可能机制方法 L615 白血病造模成功后，分为对照组和 VCR 组，进行腹腔注射给药（对照组给生理盐水） ，隔日一次，连续 6 次观测小鼠生存时间，体重变化，外周血白细胞计数，肝脾指数，肝脾骨髓涂片及骨髓白细胞分类，流式细胞术测定凋亡率结果对照组体重明显减轻，VCR 组体重无明显改变； VCR组小鼠生存时间是对照组的 229%；外周血象，同组小鼠随病程的延长，白细胞逐渐上升，至濒死期则显著上升，与实验前比较有显著差异，且对照组更为显著，而血小板是先升后降，至濒死期，末梢血对照组出现大量 L615 白血病细胞，占白细胞总数的52.9%，VCR 组 L615 白血病细胞占 17.25%，两者具有显著差异（P<0.01） ；白血病死亡小鼠脾脏指数有差异(P<0.05)，且VCR 组脾指数大于对照组；流式细胞术证实，VCR 能诱导 L615 白血病体内细胞凋亡，凋亡率达 43.81%结论 VCR 对 L615 白血病具有较好的疗效，其机制主要是诱导白血病细胞凋亡；VCR 在抗肿瘤的同时，可能对正常组织尤其是免疫系统具有一定的损害作用。

2【关键词】 长春新碱 L615 白血病 生命延长率 细胞凋亡 流式细胞术Abstract:ObjectiveTo discuss the curative effects and the potential mechanisms to the L615 leukemia of VCR. MethodsAfter making the model successfully, put the mice into 2 groups, antitheses one and VCR group. Then carry on the celiac injection (the antitheses one with NS), once every other day, and totally 6 times. Observe the survival time, weight changes, peripheral blood leukocyte count, hepatosplenic index, hepatic, splenic and marrow swears and marrow leukocyte classification and apoptosis rate determined by FCM.ResultsThe antitheses group’s weight declined significantly; but no obvious changes in VCR group were observed. The survival time of VCR group was 229% of the antitheses one. For the peripheral blood, with the course of diseases extending, the leukocytes increased and notably in the dying period (notably differences compared with the situation before the experiment, especially in antitheses group); the platelets first increased and then decreased and till the dying period. There were large amount of L615 cells in the peripheral blood of antitheses group (52.9% of the 3leucocyte number); 17.25% in VCR group was L615 cells, but there were still great differences between the two groups(P<0.01). The splenic indexes of the dead mice were different (P<0.05), and that of VCR group was greater. FCM proved that VCR induced the apoptosis of L615 cells in vivo, and the rate reached to 43.81%. ConclusionVCR has good curative effects on L615 leukemia. To induce the apoptosis of leukemia cells is its main mechanism. It may damage the normal tissues, especially the immune system when it is repelling the tumor.Key words:VCR; L615 leukemia; Life extension rate; Apoptosis; FCM长春新碱（VCR)作为抗肿瘤化疗药早已应用于临床。

有实验证明 VCR 能诱导髓系白血病 HL-60，U937，K562 等细胞凋亡［1～3］ ， 这次我们利用 VCR 作用于可移植性小鼠淋巴细胞白血病——L615 白血病，观察其疗效，并探讨其可能机制1 材料与方法1.1 药品及试剂4VCR 为上海华联制药有限公司产品（批号：050602A ） ，用生理盐水配成浓度为 25 μg/ml 的 VCR 溶液备用细胞凋亡检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品1.2 细胞培养 L615 白血病细胞株购于中国医学科学院血液研究所（天津） 培养基为含体积分数 10%的小牛血清（杭州四季青）的 RPMI-1640（Gibco 公司产品） ，并加入双抗（青霉素 100 μ/ml 和链霉素 100 μg/ml）, 在 37℃，5%CO2 饱和湿度的培养箱（Therno Forma 公司产品）中培养，取对数生长期细胞进行造模1.3 模型建立 取对数生长期 L615 白血病细胞（L615 细胞） ，离心 1 500 r/min,8 min,去上清液，用生理盐水洗涤 2 次，调整细胞终浓度为1.4×106/ml取 615 近交系小鼠（购自中国医学科学院血液研究所）8 只，鼠龄 10 周，体重 24～27 g，雌雄各半。

无菌操作，每只小鼠腹腔接种 L615 细胞 7×105 个，造成 L615 白血病模型（全身白血病） ［4］ 小鼠在层流架内饲养，一切与鼠接触的物品均按无菌要求处理51.4 分组及给药方法将 L615 白血病模型小鼠随机分为 2 组每组雌雄各半，即对照组（L615 模型组）( 每次每只鼠给生理盐水 0.4 ml) ；VCR 组（每次每只鼠给 VCR 0.3 mg/kg） 模型建立后，第 2 天开始按以上方案腹腔注射给药，隔日 1 次，共给药 6 次1.5 观测指标①体重变化；②生存时间，用公式（T-C）/C×100%计数其生命延长率（T、C 分别为 VCR 组，对照组平均生存天数） ；③外周血白细胞（WBC ）计数及分类，血小板（PLT）计数；④肝脾指数；⑤肝、脾、骨髓涂片及骨髓白细胞分类1.6 流式细胞术（ FCM）分析取濒死期两组小鼠外周血，每个样本 0.5ml 入已加淋巴细胞分离液的试管内，离心 1500r/min，20min，然后小心吸出位于中间的白色层（白细胞） ，进行细胞计数（每个样本细胞数应大于1×106） ，用 PBS 洗涤，然后按凯基 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒要求进行操作。

上机检测（流式仪为 BECTON DICKNSON,B、D 公司产品） ，采用 CenQuest 软件获取 10 0006个细胞，ModFitlt 软件分析并获得结果1.7 统计学处理采用双侧 t 检验，P<0.05 认为差异有显著性2 结果2.1 体重变化VCR 组给药前，给药后第 5 天及濒死期小鼠体重无明显改变，但对照组濒死期与给药前比较，体重有所减轻，且具有显著性差异（P<0.05） 结果见表 1表 1 两组小鼠体重的变化比较(略)g2.2 生存时间VCR 组与对照组比较, 生存时间显著延长（P<0.01 ） ，其延长时间及生命延长率见表 2表 2 两组小鼠生存时间比较（略）2.3 外周血象给药 5 d 后，同组与实验前比较白细胞及血小板数逐渐上升，且 VCR 组血小板增高有显著意义进入濒死期，白细胞数显著增高7（P<0.01） ，L615 模型组呈直线上升，两组比较具有显著差异，血小板先升后降，同组比较具有显著差异在给药后第 5 天外周血未发现 L615 细胞，但进入濒死期模型组白血病细胞骤增至50.25%，VCR 组 L615 细胞占 17.25%，与对照组比较，具有显著性差异。

结果见表 3表 3 两组小鼠外周血 WBC，PLT 计数及L615 细胞百分比比较（略）2.4 肝脾指数解剖两组死亡小鼠，发现肝、脾明显肿大，VCR 组脾肿大更显著肝脏指数差异不显著，但脾脏指数 VCR 组比对照组显著增高（P<0.05） 结果见表 4表 4 两组小鼠肝脾指数比较（略）2.5 肝、脾、骨髓涂片及骨髓白细胞分类对照组及 VCR 组小鼠死亡后，取其肝、脾、骨髓进行涂片（解剖时见胸腹部皮下有出血点且对照组出血点更广泛而密集，多处形成淤斑） ，瑞氏染色油镜下可见，两组肝、脾、骨髓内绝大部分为 L615 细胞，且生长旺盛，细胞体积比体外培养时显著增大，形状不规则，胞浆少，嗜碱性，核浆比例严重失调，胞核体积远大于胞浆；核染色质粗，核仁 1～数个总的印象：肝、脾、骨髓内L615 细胞形态结构相似，但 VCR 组脾内细胞体积比肝、骨髓内的8要大，强嗜碱性（图 1） 骨髓白细胞分类见表 5VCR 组 L615 细胞百分比比对照组少但无统计学意义表 5 两组小鼠骨髓 WBC 及L615 细胞百分比比较（略）2.6 流式细胞仪测定白细胞凋亡率根据 FCM 检测结果可知（图 2） ，VCR 对 L615 白血病小鼠白血病细胞具有强的诱导凋亡作用，凋亡百分率达 43.81%，而对照组仅为 0.33%（UR 代表右上象限百分率，为晚期凋亡，LR 代表右下象限百分率，为早期凋亡，两者之和为凋亡细胞百分率） 。

结果见表 6表 6 两组小鼠白细胞凋亡率比较（略）3 讨论本研究结果显示：VCR 作用于 L615 白血病小鼠后，能显著延长小鼠生命，生命延长率达 229%；试验前后， VCR 组小鼠体重变化不大，而对照组体重明显减轻；外周血象随着 L615 小鼠病程延长，白细胞数逐渐升高，而血小板是先升后降病程进入濒死期，白细胞则显著增高，对照组更为显著，但血小板却显著降低，这与解剖所见对照组皮下出血更严重相一致这说明 VCR 对 L615 细胞侵犯骨髓具有抑制作用流式细胞术证实，VCR 能诱导 L615 白血病小鼠体内白血病细胞的凋亡，这说明 VCR 对 L615 白血病具有疗9效，其机制之一是诱导细胞凋亡脾脏涂片显示两组脾脏显著增大，但 VCR 组脾脏高度肿大，含大量 L615 细胞，这说明 L615 细胞已严重侵入免疫系统，VCR 对机体免疫系统不具保护作用，这与文献［5］相一致在病程晚期，肝、脾、骨髓发现大量 L615 细胞，说明 VCR 在抗肿瘤的同时。