麝香酮对原代大鼠脊髓神经细胞的保护研究.docx

麝香酮对原代大鼠脊髓神经细胞的保护研究 郭亮 桂菲 李睿夫 于超 罗远盟【摘 要】目的：评估麝香酮对原代大鼠脊髓神经细胞的保护作用方法：采取2mm间距行“井”法对培养的星形胶质细胞进行划伤，建立星形胶质细胞的机械损伤模型，在模型中加入500mmol/l谷氨酸共培养，建立星形胶质细胞机械-化学损伤模型，分别在6h、12h、24h、48h、72h作MTT检测实验分组：A组（单纯培养），B组（机械化学损伤组），C组（B组中加入3ug/ml麝香酮），D组（B组加入6ug/ml麝香酮），E组（B组加入12ug/ml麝香酮），在3h、6h、12h时检测 SOD、MDA、LDH及细胞内Ca2+结果：获得了95%以上的高纯度的脊髓星形胶质细胞建立了大鼠原代脊髓星形胶质细胞机械化学损伤模型SOD检测提示：A组无明显的变化，B组明显的下降，C、D、E组比B组高，以D组在同一时间点最明显MDA检测提示A组无明显的变化，B组比A组升高，C、D、E组比B组明显低，D组在同一时间点最低细胞内钙检测与MDA有类似的变化，C、D、E组与A组和B组有显著性差异（P【关键词】麝香酮，星形胶质细胞，炎症反应，保护创伤性脊髓损伤（trauma spinal cord injury， SCI）的发病率有逐渐升高的趋势 [1]，SCI 及其继发性损伤可直接导致神经功能损伤，出现不同程度的功能障碍，并且脊髓损伤治疗困难[2]， 因此致残率与致死率非常高[3] 。

脊髓损伤后炎症因子会刺激星形胶质细胞的增殖和活化[4]过度生长的星形胶质细胞也会形成胶质疤痕，作为物理和化学屏障阻止神经元轴突再生[5]减轻继发性损伤的关键是保护损伤细胞，抵抗炎症，减少星形胶质细胞的增殖麝香酮具有类似糖皮质激素的抗炎作用它能抑制中性粒细胞释放炎症因子，降低钙强度[6]通过血脑屏障，提高中枢神经系统的耐缺氧能力，减轻水肿Yu等人的Invitro实验表明，麝香酮可以减少LDH的释放，抑制钙的流入，并提高细胞在超剂量Glu处理的PC-12细胞中的存活率[7]Jin等人的实验表明，麝香酮可以减轻脑缺血的水肿，减轻脑细胞的病理变化[8]，说明麝香酮具有一定的抗炎作用和对中枢神经系统的保护作用本实验中选用大鼠脊髓原代星形胶质细胞进行体外培养，并建立损伤模型，运用不同浓度的麝香酮对星形胶质细胞损伤作用，检测TNF-α、IL-1B、SOD、MDA，LDH、细胞内钙的测量及对细胞进行计数，探讨麝香酮对脊髓星形胶质细胞保护作用1.材料与方法1.1原代脊髓星形胶质细胞的分离及纯化取新生乳鼠10只无菌条件下剪刀断头，打开脊椎后完整取出脊髓组织将脊髓组织剪碎致直径0.1mm左右小块化学消化收集细胞悬液。

弃去上清液，然后每管加入2-3 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，接种于培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱内孵育60分钟，进行差速粘附贴壁处理，以去除成纤维细胞 24小时后翻转培养瓶收集的贴壁细胞，继续培养即可得纯度达到95%以上的星形胶质细胞培养箱内培养，生长8-10d待细胞融和，随后使用本次获得的细胞进行传代，用于后继实验1.2免疫荧光染色法行细胞的鉴定：胶质纤维酸性蛋白（GFAP）细胞准备好后进行 细胞铺片， 吸除培养瓶中旧培养基，用PBS洗2-3次，加入0.25%胰酶消化液约1-3ml进行消化，置37℃培养箱静置约2-5分钟，加入2-3ml完全培养基，收集细胞至离心管，离心5min，弃上清加培养液，调整细胞密度为1*106个/ml，以每孔0.5ml接种到6孔板的盖玻片上待细胞12h贴壁后，吸出培养基，生长达到70%-80%，最后爬片固定，中性树胶封片1.3星形胶质细胞的机械化学损伤模型（1）建立星形胶质细胞机械损伤模型待细胞贴壁后用1ml无菌注射器针头，在4倍放大镜下进行直线划伤培养皿中脊髓星形胶质细胞，整个过程要求力度适中以保证损傷较为一致于六孔板呈“井”字划伤，划痕线之间的平行间距为0.2mm，细胞损伤前30min加入不同浓度的麝香酮进行药物预处理划。

倾斜培养皿，极其轻柔的吸去划伤后所有的培养基2）星形胶质细胞的机械化学损伤模型在机械损伤模型中加入500umol/L谷氨酸造成细胞机械化学损伤模型常规继续培养在加入Glu前30 min加入3 ug/ml、6 ug/ml、12 ug/ml 的麝香酮进行药物预处理3）损伤模型的鉴定台盼蓝染色法测定细胞死亡率在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞镜下观察死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状 统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）100%细胞死亡率的计算：细胞死亡率（%）=死细胞数/（活细胞数+死细胞数）100%4）星形胶质细胞的实验分组A组（单纯培养），B组（机械化学损伤后继续培养），C组（B组加入3ug/ml麝香酮500ul/孔），D组（B组加入6ug/ml麝香酮500ul/孔），E组（B组加入12ug/ml麝香酮500ul/ml孔）.（5）监测指标在不时的时间点采用ELISA 法对对MDA、SOD检测和流式检测法细胞内Ca2+的浓度6）统计学处理采用SARS9.0统计软件包进行分析，所有数据以s表示，组间比较采用单因素方差分析，P值<0.05为有统计学意义。

2.结果2.1获取高纯度的脊髓星形胶质细胞在更换培养液时行10秒短期暴露与差速贴壁法相结合的方法，获取了纯化后的脊髓星形胶质细胞采用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫化学细胞染色鉴定，在培养3天时在光镜下观察见星形胶质细胞主要呈梭形、不规则形态或星形，细胞质丰富、细胞核大，染色质浅而均匀，多为1个核仁，偶见有2个核仁其胶质细胞纯度达95%以上 （图1）2.2成功建立了原代星形胶质细胞机械化学损伤模型采用台盼蓝染色法测定细胞死亡率正常組培养6小时、24小时未见死亡细胞在6小时机械损伤模型死亡率在13.23%，细胞存活率87.73%;在机械化学损伤模型后死亡率在21.12%，细胞存活率78.88%;24小时，在机械损伤模型死亡率在23.57%，细胞存活率76.43%;在机械化学损伤模型后死亡率在36.27%，细胞存活率63.73%2.3细胞流式法检测细胞内Ca2+正常组在同一时间点最低，有缓慢上升; 模型损伤组明显增加，在3h、6h、12h荧光值分为22.67、30.00、31.03，处理组中都明显的下降，以D组在同一时间点最明显，在分别为17.21、25.21，25.31 （图2）2.4 ELISA法检测丙二醛（MDA及超氧化物歧化酶（SOD）脊髓星形胶质细胞在体外培养过程中，正常组无明显的变化，机械化学损伤组较正常组明显的下降在3h、6h、12h，分为72.11 ng/L、76.55ng/L、85.56ng/L，处理组中都明显的下降，以麝香酮6ug/ml组在同一时间点最明显，在3h、6h、12h达55.56 ng/L、51.89ng/L，78.94ng/L。

处理组与正常组和损伤组有显著性统计学差异（图3）脊髓星形胶质细胞在体外培养过程中，正常组无明显的变化，机械化学损伤组明显下降在3h、6h、12h，分为28.52 ng/L、24.53ng/L、22.33ng/L，处理组中都明显的提升，以麝香酮6ug/ml组在同一时间点最明显，在3h、6h、12h达46.74 ng/L、42.01ng/L，38.33ng/L处理组与正常组及损伤组有显著性统计学差异（P<0.01）图4）3.讨论3.1细胞培养与鉴定对原代神经细胞培养研究，是研究脊髓损伤机制的主要方法之一[1]脊髓损伤后所引起的一系列炎性反应及对伤脊髓的保护作用，很大程度上通过星形胶质细胞起作用获得较为单一高纯度的星形胶质细胞是进行深入研究的基础，选用新生大鼠也有利于获得高纯度的星形胶质细胞， 因为星形胶质细胞的分裂高峰发生在动物胚胎晚期及出生以后[9]差速贴壁法[10]是利用星形胶质细胞、成纤维细胞与嗅鞘细胞的贴壁时间不同而将它们分离的方法成纤维细胞的贴壁能力强，在未被包被的光滑玻璃平面上，在细胞接种1小时之内就可直接贴壁，星形胶质细胞一般在接种的24h左右贴壁，而嗅鞘细胞则需要96-120h内贴壁。

本实验选择，通过两次恒度摇床振荡，神经细胞、少轴突细胞、小胶质细胞星形胶质细胞能在无培养液状态下能成活40小时[11]，将培养液吸干换液时，使培养细胞暴露于空气中10秒钟可以除去少突胶质细胞[12]但是为了提高星形胶质细胞的生存能力、活性及传代能力，在更换培养液时注意避免过长的暴露时间因为一般在原代培养时采用相对较低的接种密度，因神经元不再分裂增殖，且传代后大多会死去本实验采用星形胶质细胞标志性蛋白：胶质纤维酸性蛋白（GFAP）行行细胞免疫化学染色来鉴定，通过计数统计，星形胶质细胞的纯度达95%，获得了纯度较高的星形胶质细胞，能满足本次实验的要求若要得到纯度更高的星形胶质细胞，而又不影响星形胶质细胞的培养，可采用聚合酶链反应法 3.2细胞损伤模型的选择本实验通过张杰敏[12]等提供的方法成功的建立体外星形胶质细胞机械损伤模型[16]，直接的损伤致坏死，损伤缘的胶质增生肥大明显，对于未损伤区，细胞形态正常，说明损伤的程度不重，而选用20ul移液器吸头作划伤时的工具，有大量的胶质细胞被拖至划痕的尾端，实验损伤的程度不重，后改用针头后检测量SOD、MDA较前有明显变化考虑到单纯机械损伤因没有与其它细胞共培养，培养缺乏在体损伤时可因神经元损伤，在多种因素介导下出现谷氨酸的增加，不能模拟其脊髓损伤后的病理状态，同时单独作谷氨酸诱导下的的化学损伤，可能又缺少机械因素下的细胞直接的损伤，及损伤所诱导下的病理生理变化，都不能很好的模拟临床上的微环境变化，故本实验选用了机械损伤后再加入谷氨酸，建立了脊髓星形胶质细胞机械化学损伤模型，进行研究。

3.3麝香酮的作用效果在机械化学损伤下，脊髓星形胶质细胞出现机械性损伤造成细胞原发性损伤，LDH是细胞无氧酵解过程中的一种关键酶，在机械化学损伤的作用下，当细胞膜完整性遭到破坏时，细胞膜通透性增高，胞的大量LDH从浆中释放到细胞外，并与细胞损伤程度呈正相关因此，将LDH释放量作为评价星形胶质细胞受损伤的一般指标同时培养液中大量的谷氨酸和机械损伤所引起的细胞损害，激活了细胞膜上的谷氨酸转动蛋白，钙内流增加致，线料体内的钙增加，引起细胞膜及细胞器脂质代谢异常，细胞膜及细胞器脂代谢产物MDA大量产生，自由基大量释放，消耗了大量的SOD，出现SOD急剧下降触发星形胶质细胞增生，释放TNF-α等炎症因子，又反馈加重细胞损伤而这类炎症因子可以作为炎症反应被激活的标志物麝香酮是一种有效的抗炎剂，能降低免疫炎症细胞因子，包括IL-6、IL-B、TNF-α、基质金属蛋白酶、环氧化酶、NO等的水平， PC12细胞降低钙内流本次实验结果显示，3-12ug/ml麝香酮处理后都减少由机械化学损伤所致的的细胞损伤，降低了LDH漏出，抑制了MDA的释放，增加了SOD产量麝香酮能明显抑制机械化学损伤所引起的脊髓胶质细胞的炎症反应。

但其作用机制不清楚，需进一步深研究通讯作者：桂菲）参考文献[1] Center， N. S. C. I. S. （）. Facts and figures at a glance[J]. Birmingham， AL： University of Alabama at Birmingham， 20161-2.[2] Alexandre Fogac?a Cristante， at al.Therapeutic approaches for spinal cord injury[J].CLINICS.2012，67（10）：1219。