双向电泳原理及实验步骤ppt课件.ppt

蛋白质组双向电泳实验操作1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组〔Proteome〕的概念，其定义为在一种细胞内存在的全部蛋白质蛋白质组研究中主要应用的技术包括：双相电泳(2-DE)、新型质谱(MS)技术、数据库设置与检索系统等蛋白质组分析的首要要求•将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 •2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 生物学问题生物学问题的提出的提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备蛋白样品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现新蛋白质的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备双向电泳双向电泳图像分析图像分析转印至膜上的蛋白转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白质质量蛋白质质量N端测序端测序肽序列质谱数据肽序列质谱数据肽指纹图肽指纹图数据搜索数据搜索新的或已知蛋白新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白转录后修饰的鉴定一、双向电泳的实验原理一、双向电泳的实验原理+–pH 3pH 7.5pH 10+–pH 3pH 7.5pH 10+–pH 3pH 7.5pH 10+–pH 3pH 7.5pH 10第一向：等电聚焦第一向：等电聚焦一一维固相固相pHpH梯度等梯度等电聚焦聚焦（（IEF￿with￿IPGIEF￿with￿IPG）：）：￿ ￿•IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3-10不同值的缓冲体系。

根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态￿–chargesize第二向：第二向：SDS-PAGE电泳电泳Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their size.Smallest proteins travel the furthest distance+pH 3pH 7.5pH10样品制备基本原则样品制备基本原则•使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态〔包使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态〔包括多数疏水性蛋白），制备方法应具有可重现性括多数疏水性蛋白），制备方法应具有可重现性•防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀•防止在样品制备过程中发生样品抽提后的化学修防止在样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰〔如酶性或化学性降解等）饰〔如酶性或化学性降解等）•完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。

完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白•尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性保证待研究蛋白的可检测性样品制备样品制备•细胞样品：反复冻融、超声破碎•组织样品：碾磨、匀浆•植物样品：碾磨•分泌蛋白•蛋白质样品的浓缩、去除滤液中的高丰度蛋白•菌体蛋白•裂解液处理、超声破碎可溶性样品可溶性样品 固体组织样品固体组织样品 细胞细胞不同样品的基本处理方法不同样品的基本处理方法样品的分级处理样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质当前最简单有效的处理是采用分富集低丰度蛋白质当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离级抽提，按样品溶解度不同进行分离 双向电泳样品的溶解双向电泳样品的溶解•是成功进行双向电泳的最关键因素之一•溶解的目标：•样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液；•必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；•保证样品在电泳过程中保持溶解状态。

增加样品溶解性的手段增加样品溶解性的手段离液离液剂：通：通过改改变溶液中的溶液中的氢键结构使蛋白构使蛋白质充分伸展，充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域典型代表是尿素和硫尿典型代表是尿素和硫尿去垢去垢剂：：经过离液离液剂处理而暴露蛋白理而暴露蛋白质的疏水基的疏水基团后，后，还常需至少一种去垢常需至少一种去垢剂来溶解疏水基来溶解疏水基团常用的去垢常用的去垢剂有离子去有离子去污剂SDSSDS、非离子去、非离子去污剂Triton￿X-100Triton￿X-100和和NP-40NP-40、两性离子去垢、两性离子去垢剂CHAPSCHAPS、、OBGOBG等其中CHAPSCHAPS应用最普遍用最普遍还原原剂：在离液：在离液剂和去垢和去垢剂联用条件下，加用用条件下，加用还原原剂可可使已使已变性的蛋白性的蛋白质展开更完全，溶解更展开更完全，溶解更彻底常用含底常用含自由自由巯基的基的DTTDTT或或 - -巯基乙醇，以及不基乙醇，以及不带电荷的三丁基荷的三丁基膦〔〔TBPTBP〕〕进行行还原两性两性载体体电解解质：即便在离液：即便在离液剂和去垢和去垢剂存在的情存在的情况下，某些蛋白况下，某些蛋白质也需要在也需要在盐离子的作用下才能保离子的作用下才能保持其持其处于溶解状于溶解状态，否，否则这些蛋白些蛋白质在其在其处于于PIPI点点时会会发生沉淀。

生沉淀两性两性载体体电解解质的作用在于的作用在于补充充样品中少量的品中少量的盐分，分，从而保从而保证蛋白蛋白质的溶解性的溶解性应用用时，两性，两性电解解质的的浓度度应小于小于0.20.2％（％（w/v)w/v)浓度度过高会使高会使IEFIEF的升的升压困困难、速度降低另外，、速度降低另外，为了保了保证实验的精确性，的精确性，在在选择不同不同pHpH范范围的的IPGIPG胶条胶条时，也，也应使两性使两性电解解质的的pHpH值与之相符合与之相符合样品上样缓冲液样品上样缓冲液标准溶液：ReagentAmount8M urea47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O50mM DTT or2mM TBP385mg or 500ul of 200mM TBP stock4% CHAPS2g0.2%carrier ampholytesSee next table0.0002%bromophenol blue100ul of 0.1% stockddH2OTo 50ml胶条蛋白载样量胶条蛋白载样量影响影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：胶条对蛋白载样量的因素包括：待分析的蛋白点的量需满足随后的质谱分析。

待分析的蛋白点的量需满足随后的质谱分析电泳的研究目的电泳的研究目的待研究蛋白的丰度：待研究蛋白的丰度：样品的复杂度样品的复杂度IPG胶条的胶条的pH范围范围IPG胶条蛋白质大约载样量胶条蛋白质大约载样量IPG Strip lengthAnalytical Load(silver staining)Preparative Load(Coom staining)7cm10~100   g /125   l200~500ug/125   l11cm50~200   g /185   l250~1000ug/185   l17cm100~300   g/300   l1~3mg/300   l蛋白质样品的上样量蛋白质样品的上样量Enhanced Resolution for Detection of Low Abundance Proteins等电聚焦中等电聚焦中pH梯度的选择梯度的选择 先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定ReadyStrip IPG Strip pH Ranges3 4 56 7 89 10Non-linear3.9-5.14.7-5.95.5-6.76.3-8.3Broad Range SeparationsTools to separate an entire sample on a single gelpH 3-10Complete linear viewpH 3-10NLImproved separation of crowded pH 4-8 zonepH 3-10pH 3-10NLMore Data with Narrow Range IEFpH 3-10pH 3- 6pH 5- 8pH 7-10IPG EffectiveStrip pH OverlappingLength RangeGel Area24 cm 3-10 56 cm18 cm 3-10 44 cm17 cm 3-10 40 cm11 cm 3-10 26 cm 7 cm 3-10 16 cm聚焦时间的优化聚焦时间的优化•要获得高质量的图谱以及很好的试验重复性，所需的最佳时间即为等电聚焦达到稳定态所需的时间。

•聚焦最佳时间由不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定•聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现•过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出〔电渗〕而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失IEFIEF的基本条件的基本条件Stemp 1Stemp 2Stemp 3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5 hr14,000V-hr7 cmStemp 1Stemp 2Stemp 3totaltotalStemp 1Stemp 2Stemp 311 cm17 cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3 hr7 hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid两维间的平衡两维间的平衡•等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电泳，也可于－80°保存数月。

•但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS-PAGE电泳能顺利进行•建议方案：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mM￿Tris〔pH8.8〕缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15min如果用TBP代替DTT则只需一步平衡￿￿二维二维SDS-PAGE•同普通SDS-PAGE类似•但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶〔低浓度丙烯酰胺胶〕充当了浓缩胶 Second Dimension SDS-PAGEMultiple Gel FormatsMiniCriterionPROTEAN1°: 60 g sample, 20 kV-hr2°: 8.6 x 6.8 cm, 40 min944 spots1°: 100 g sample, 50 kV-hr2°: 13.3 x 8.7 cm, 1 hr1,287 spots1°: 150 g sample, 80 kV-hr2°: 18.3 x 19.3 cm, 5.5 hr1,724 spots聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测的蛋白质的检测理想显色剂的理想显色剂的7S平安〔平安〔safety）：）：灵敏〔灵敏〔sensitivity）：）：简单〔简单〔simplicity）：）：特异性〔特异性〔specificity）：）：快速〔快速〔speed）：）：稳定〔稳定〔stability）：）：兼容性〔兼容性〔synergy）：）：适用于质谱的染色方法适用于质谱的染色方法•考马斯亮兰〔Bio-Safe™ Coomassie™ colloidal 250 stain） •银染〔Silver Stain Plus™ stain）•荧光染色〔SYPRO® Ruby protein gel stain）考马斯亮蓝染色•考马斯亮蓝检测范围30-100ng，灵敏度较低，但染色过程简单，所需试剂少，操作简便，无毒性，染色后背景及对比度好，与下游质谱兼容，线性程度好。

•胶体考马斯亮蓝染色的检测灵敏度为8-10ng，但染色时间较长〔24-48小时），染色过程给下游质谱检测带来较多不便•Bio-Safe染料是一种改良的胶体金染色方法安全无污染，染色非常快〔2小时），完全与下游质谱兼容银染银染•银染的检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容•快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰•Bio-Rad有两种银染试剂盒：•普通银染试剂盒——质谱不兼容•增强型银染试剂盒——质谱兼容荧光染料荧光染料•SYPRO Ruby染料•灵敏度2-10ng，灵敏度与银染相仿，不对核酸染色•染色所需时间较短•染色的动态线性范围大大优于胶体金染色，扩展了约1000倍•荧光试剂显色对蛋白质无固定作用，不干扰质谱或免疫检测过程•Cy3和Cy5•两种染料可分别对两种蛋白质样品进行荧光标记，在一块2-D胶上同步运行，可以很方便的找出差异•但因其需要对蛋白质进行共价修饰、改变了标记蛋白质的移动性能•由于荧光探针猝灭作用会引起快速衰减蛋白与蛋白之间由于可被荧光团修饰的功能基团数目不同而使得灵敏度变化很大•荧光团的加入会降低蛋白质溶解性能。

凝胶的图像处理分析凝胶的图像处理分析典型流程典型流程凝胶图像的扫描：凝胶图像的扫描：图像加工：图像加工：斑点检测和定量：斑点检测和定量：凝胶配比：凝胶配比：数据分析：数据分析：数据呈递和解释：数据呈递和解释：2-DE数据库的建立：数据库的建立：综合的数据管理综合的数据管理PDQuest ImageDifferential AnalysisSpot CuttingProtein DigestionMass SpecPMF / MS-MSGlobal DatabaseSearch / Protein IDPDQuest ImageAuto-annotationPDQuest Work FlowAcquire the ImageTransform the ImageIdentify the SpotsCompare ImagesAnalyze the DataExcise SpotsAcquire MS DataPublish a ReportØ 样品制备〔Sample preparation）Ø固相预制胶条的水化〔IPG strip rehydration）Ø第一向等电聚焦〔IEF）Ø胶条的平衡〔IPG strip equilibration）Ø第二向SDS-PAGE电泳〔SDS-PAGE electrophresis）Ø凝胶的染色及检测〔Detection/Staining）ØPDQuest软件分析〔Software analysis）Ø质谱鉴定〔Protein identification） 二、双向电泳实验流程二、双向电泳实验流程 •最高电压10,000 V•10–25C 温度控制•7, 11, 17, 18, 和 24 cm的聚焦盘，可以各放12根胶条•可以储存10个程序，每个程序有10步•程序可进行时时编辑•可供选配的打印机等电聚焦的操作等电聚焦的操作1. 取出IPG预制胶条〔7cm pH 4-7），室温平衡。

2. 在聚焦盘或水化盘中加入样品〔图1）3. 去除预制IPG胶条上的保护层〔图2） 4. 将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中〔图3） 5. 在每根胶条上覆盖1ml矿物油6. 对好正、负极，盖上盖子7. 设置等电聚焦程序等电聚焦的操作等电聚焦的操作1. 取出IPG预制胶条〔7cm pH 4-7），室温平衡2. 在聚焦盘或水化盘中加入样品〔图1）3. 去除预制IPG胶条上的保护层〔图2） 4. 将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中〔图3） 5. 在每根胶条上覆盖1ml矿物油6. 对好正、负极，盖上盖子7. 设置等电聚焦程序等电聚焦的操作等电聚焦的操作1. 取出IPG预制胶条〔7cm pH 4-7），室温平衡2. 在聚焦盘或水化盘中加入样品〔图1）3. 去除预制IPG胶条上的保护层〔图2） 4. 将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中〔图3） 5. 在每根胶条上覆盖1ml矿物油6. 对好正、负极，盖上盖子7. 设置等电聚焦程序等电聚焦程序的设置等电聚焦程序的设置7cm胶条胶条水化水化12小时〔小时〔17℃））被动水化被动水化S1250V慢速慢速30分钟分钟除盐除盐S21000V快速快速60分钟分钟除盐除盐S34000V线性线性3小时小时升压升压S44000V快速快速24,000伏小时伏小时聚焦聚焦~28,000伏小时伏小时S5500V快速快速任意时间任意时间坚持坚持l   选择所放置的胶条数。

选择所放置的胶条数l   设置每根胶条的极限电流设置每根胶条的极限电流30-50 A/根）根）l   设置等电聚焦时的温度设置等电聚焦时的温度17℃））配制配制SDS-PAGE凝胶凝胶1.配制12%的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电泳专用梳子；或在上部留0.5cm的空间，用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶聚合30分钟2.待凝胶凝固后，拔去梳子，用MilliQ水冲洗；或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗，备用 胶条的平衡胶条的平衡1.冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟2.配制胶条平衡缓冲液￿I￿3.吸去胶条上的矿物油及多余的样品4.第一次平衡振荡15分钟5.￿配制胶条平衡缓冲液￿II￿6.第二次平衡￿，振荡15分钟7.吸去玻璃板中液体将玻璃板倒扣在桌面上8.琼脂糖封胶液进行加热溶解配制1×电泳缓冲液胶条的转移胶条的转移 1.平平衡衡结结束束后后，，先先将将IPG胶胶条条完完全全浸浸末末于于1×电电泳泳缓缓冲冲液液中中，，然然后后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上〔图将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上〔图4、图、图5）2.将将放放有有胶胶条条的的SDS-PAGE凝凝胶胶转转移移到到灌灌胶胶架架上上，，在在凝凝胶胶的的上上方方加入低熔点琼脂糖封胶液〔图加入低熔点琼脂糖封胶液〔图-6）。

3.用用镊镊子子、、压压舌舌板板或或是是平平头头的的针针头头，，轻轻轻轻地地将将胶胶条条向向下下推推，，使使之之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触〔图与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触〔图-7）4.放置放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固胶条的转移胶条的转移 1.平平衡衡结结束束后后，，先先将将IPG胶胶条条完完全全浸浸末末于于1×电电泳泳缓缓冲冲液液中中，，然然后后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上〔图将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上〔图4、图、图5）2.将将放放有有胶胶条条的的SDS-PAGE凝凝胶胶转转移移到到灌灌胶胶架架上上，，在在凝凝胶胶的的上上方方加入低熔点琼脂糖封胶液〔图加入低熔点琼脂糖封胶液〔图6）3.用用镊镊子子、、压压舌舌板板或或是是平平头头的的针针头头，，轻轻轻轻地地将将胶胶条条向向下下推推，，使使之之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触〔图与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触〔图-7）4.放置放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固胶条的转移胶条的转移 1.平平衡衡结结束束后后，，先先将将IPG胶胶条条完完全全浸浸末末于于1×电电泳泳缓缓冲冲液液中中，，然然后后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上〔图将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上〔图4、图、图5）。

2.将将放放有有胶胶条条的的SDS-PAGE凝凝胶胶转转移移到到灌灌胶胶架架上上，，在在凝凝胶胶的的上上方方加入低熔点琼脂糖封胶液〔图加入低熔点琼脂糖封胶液〔图6）3.用用镊镊子子、、压压舌舌板板或或是是平平头头的的针针头头，，轻轻轻轻地地将将胶胶条条向向下下推推，，使使之之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触〔图与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触〔图 7）4.放置放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固SDS-PAGE电泳1.￿￿￿在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后将凝胶转移至电泳槽中2.￿在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流〔5mA/gel/7cm），待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流〔15-20mA/gel/7cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳3.￿电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号〔戴手套，防止污染胶面）￿凝胶的染色•考马斯亮兰染色考马斯亮兰染色•Bio-Safe染色染色Bio-Safe 染色法染色法•水洗水洗3次，次，5min/次•Bio-Safe染色染色1小时•水洗水洗30min.图像扫描及软件分析图像扫描及软件分析 Molecular mass (kD) Isoelectric point 1 10 0 201 120 100 56 38 30 20 7 Fig1 上下图分别为正常大鼠和失神经大鼠腓肠肌蛋白双向电泳 图谱，右图为左图方框内的局部放大图。